血清金属蛋白酶组织抑制剂3和性别决定区Y框蛋白2在2型糖尿病肾损伤早期诊断中的临床应用

目的探究血清金属蛋白酶组织抑制剂3(tissue inhibitors of metalloproteinases 3,TIMP3)和性别决定区Y框蛋白2(transcription factor determining region Y box protein 2,SOX2)对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)肾损伤的早期诊断。方法选取2022年4月至2023年4月在华北石油管理局总医院就诊的102例T2DM患者为研究对象,根据24 h尿蛋白排泄率(uri-nary albumin excretion rate,UAER)将T2DM患者分为肾损伤组(n=40)和无肾损伤组(n=62),另选取同期在华北石油管理局总医院行体检的健康者50名为对照组。酶联免疫吸附法测定所有受试者血清TIMP3、SOX2水平;比较3组受试者一般资料、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,HbA1c)、UAER、血肌酐(serum creatinine,Scr)、估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)、血清TIMP3、SOX2水平;Pearson相关性分析血清TIMP3与SOX2及两者与HbA1c、UAER、Scr、eGFR之间的关系;受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)分析血清TIMP3、SOX2对T2DM患者肾损伤的诊断价值。结果T2DM患者血清TIMP3[(0.68±0.17)μg/L比(1.35±0.35)μg/L]及eGFR[(105.99±20.56)mL·min^(-1)·(1.73 m^(2))比(133.15±26.18)mL·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)]显著低于对照组(P<0.05),且肾损伤患者血清TIMP3[(0.47±0.11)μg/L比(0.82±0.21)^(-1)μg/L]及eGFR[(74.69±10.22)mL·min^(-1)·(1.73 m^(2))比(126.18±27.23)mL·min^(-1)·(1.73 m^(2))^(-1)]显著低于无肾损伤患者(P<0.05);血清SOX2[(8.91±1.82)kU/L比(5.15±1.31)kU/L]及HbA1c[(8.80±1.55)%比(5.52±0.83)%]、UAER[(70.13±18.06)mg/24 h比(13.22±3.61)mg/24 h]、Scr[(82.14±15.23)µmol/L比(53.19±5.62)µmol/L]显著高于对照组(P<0.05),且肾损伤患者血清SOX2[(10.81±2.13)kU/L比(5.15±1.31)kU/L]及UAER[(156.83±40.29)mg/24 h比(13.22±3.61)mg/24 h]、Scr[(113.77±13.58)µmol/L比(53.19±5.62)µmol/L]显著高于无肾损伤患者(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,TIMP3与UAER、Scr、HbA1c呈显著负相关(P<0.05),与eGFR呈显著正相关(P<0.05);SOX2与UAER、Scr、HbA1c呈显著正相关(P<0.05),与eGFR呈显著负相关(P<0.05);血清TIMP3与SOX2呈显著负相关(r=-0.590,P<0.05)。ROC结果显示,血清TIMP3联合SOX2诊断T2DM患者肾损伤的敏感度和特异度分别为95.0%、85.3%,显著高于TIMP3、SOX2单独测定。结论T2DM肾损伤患者血清TIMP3水平显著降低,SOX2水平显著升高,且两者与T2DM患者肾损伤密切相关,可用于T2DM患者肾损伤早期诊断。

利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

分析了健康人、Ｔ－ＡＬＬ外周血及Ｔ细胞株Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ中ＴＣＲＶβＴ细胞的表达和克隆性。应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＴＣＲＶβ２４个亚家族的ＣＤＲ３，并经基因扫描和序列分析确定Ｔ细胞克隆性。结果表明健康人表达除Ｖβ２０外的多克隆Ｔ细胞；Ｔ－ＡＬＬ仅表达３～４个Ｖβ亚家族Ｔ细胞；部分呈寡克隆性；Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ分别表达Ｖβ２和Ｖβ８单克隆Ｔ细胞。Ｔ－ＡＬＬ中存在克隆性生长Ｔ细胞。该方法是检测Ｔ细胞克隆性的敏感和精确的方法。

活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。

正常人外周血αβ T细胞TCR β链CDR3多态性和长度分析

采用免疫扫描谱型分析技术,分析正常人外周血T细胞TCRβ链CDR3的多态性和长度分布.提取6例正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)的总RNA,逆转录成cDNA,以24个TCR BV基因家族为上游引物,共同的TCR BC基因为下游引物(荧光标记),6例样品PCR产物的基因扫描分析表明,24个TCRBV家族的CDR3谱型分析在1.5%琼脂糖凝胶电泳图上显示1个模糊条带.序列测定结果显示,各TCR BV家族的CDR3谱型均超过8个条带.GeneScan分析证明,正常人外周血T细胞的24个TCR BV家族的CDR3谱型为标准的高斯分布,各家族的CDR3表达频率相近,呈现不同的CDR3多态性和不同的CDR3长度.多数TCR BV家族产物为框架内重排(相邻2个PCR产物相差3个碱基),少数TCR BV家族表现为两个峰群的重排.该研究对正常人TCRβ链CDR3谱系的详细分析将为T细胞应答、TCR重组等研究提供基础.利用免疫谱型分析技术能监测到TCR CDR3谱型分布特征和表达频率的变化.

乙型肝炎患者治疗前后外周血CD4^+CD25^+Tregs TCR CDR3谱系漂移特征分析

目的:探讨AHB患者急性期及恢复期、CHB患者恩替卡韦治疗前后外周血PBMC中CD4^+CD25^+Tregs TCR CDR3谱系漂移特征的变化。方法:采集4例正常人、3例AHB患者(急性期和恢复期)及4例CHB患者恩替卡韦治疗前后外周抗凝静脉血,分离外周血PBMC;磁珠分选法分选CD4^+CD25^+Tregs,提取总RNA,逆转录合成c DNA;根据TCRβ链24个可变区基因(TRBV)家族设计相应的上游引物,并在β链恒定区(BC)设计一条共用的FAM荧光标记下游引物及对照引物。PCR扩增出24个包含完整CDR3区的TRBV家族的PCR产物,电泳鉴定目的片段;PCR产物送上海基康用毛细管电泳法进行基因扫描;用Peak Scanner Software v1.0软件分析研究对象TRBV家族CDR3谱系特征;采用配对t检验(paired-sample t test)检测AHB患者急性期及恢复期、CHB患者恩替卡韦治疗前后TRBV家族谱系漂移率差异。结果:3例AHB患者急性期呈现普遍谱系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢复期多转变为正态的多峰谱型,AHB患者恢复期外周血CD4^+CD25^+Tregs TRBV家族CDR3谱型漂移率显著低于急性期(t=9.456,P=0.011);TRBV8、11、13.2、15、16、18、20在3例CHB患者抗HBV治疗前出现克隆增生,TRBV1、5.2、6、12、14、24在3例CHB患者抗HBV治疗后出现克隆增生。CHB患者抗病毒治疗后TRBV家族CDR3谱型漂移率高于治疗前(t=-0.666,P=0.553)。结论:AHB患者急性期呈现谱系漂移的TRBV4、10、14、16、19家族在恢复期多转变为正态的多峰谱型,推测这种转变可能与HBsAg、HBeAg转阴相关。CHB患者在治疗前TRBV8、11、13.2、15、16、18、20家族克隆增生的Tregs可能通过下调机体的细胞免疫应答,阻碍病毒清除;随着药物导致病毒载量的显著下降,TRBV1、5.2、6、12、14、24家族克隆增生的Tregs可能更有助于诱导机体出现免疫耐受,导致HBV不能彻底清除。

利用 Genescan 分析 TCRVβ 亚家族CDR3长度的方法检测AML的T细胞克隆性

分析急性髓性白血病（ＡＭＬ）的Ｔ细胞克隆性，方法利用反转录一多聚酶链反应（ＲＴ┐ＰＣＲ）法分析５例ＡＭＬ、８例正常人的外周血单个核细胞和Ｔ细胞株Ｊｕｒｋａｔ的Ｔ细胞受体ＴＣＲＶβ２４个亚家族的互补决定区３（ＣＤＲ３）长度，ＰＣＲ产物进一步进行基因扫描（ｇｅｎｅｓｃａｎ）和核苷酸序列分析。结果ＲＴ┐ＰＣＲ分析显示８例正常人外周血单个核细胞除Ｖβ２０外，存在各Ｖβ亚家族的Ｔ细胞，而５例病人则仅存在部分亚家族的Ｔ细胞，Ｊｕｒｋａｔ细胞则仅表达Ｖβ８亚家族，基因扫描分析显示３例病人的个别亚家族产物呈一主峰图像，而对照组８例正常人的全部Ｖβ产物均显示为多峰图像，Ｊｕｒｋａｔ细胞的Ｖβ８家族ＰＣＲ产物呈单峰。结论ＡＭＬ病人外周血存在克隆性生长Ｔ细胞，这可能是宿主对白血病相关抗原的直接反应。该方法可以作为一种新的临床研究方法用于检测微小残留病变。

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体介导的αβT细胞CDR3谱系漂移

目的探讨抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-1)介导的αβT细胞CDR3谱系漂移,为双特异性抗体介导的T细胞免疫应答机制提供理论基础。方法采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员T细胞在人卵巢癌SKOV3细胞联合BHL-1刺激前后的TCR库多样性变化(CDR3谱型分布特征)及刺激后T细胞TCRα、β链CDR3优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果刺激前6例正常献血员TCR CDR3谱型均呈高斯分布,刺激后发生CDR3谱系漂移,部分TCR Vα、Vβ家族出现优势增生,明确了BHL-1介导下单克隆增生T细胞的α、β链CDR3序列。结论 SKOV3联合BHL-1诱导的T细胞CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与BHL-1介导的特异性T细胞免疫反应有关,特异应答T细胞TCR CDR3序列的确定,将为卵巢癌的T细胞免疫治疗提供基础。

“荧光定量PCR溶解曲线法”监测人TCRβ链CDR3谱系漂移技术的建立

目的建立"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取4例正常人、9例大肠癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell-PBMC)中的总RNA,逆转录成cDNA,以26个人TRBV基因家族设计上游引物,共同的TRBC基因设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果正常人外周血T细胞TCRβ链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"(melting curve spectratyping)呈现溶点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布;9例大肠癌患者的外周血TCRβ链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,有的患者部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论"荧光定量PCR溶解曲线分析TCR CDR3谱系漂移技术",方法稳定简便,能较好的监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

IL-2体外诱导健康人外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的研究

目的研究IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移的影响。方法分离健康志愿者外周血T细胞,加入IL-2,常规体外培养,乳酸脱氢酶释放法检测其非特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术,分析其CDR3长度以判断T细胞的克隆性。结果3例健康志愿者外周血T细胞对鼻咽癌细胞系CNE2没有杀伤作用;PBMC的TCRVβCDR3谱型均呈高斯分布,经IL-2体外培养后部分家族出现不同的优势表达。结论IL-2对体外培养的T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移有一定影响,对其非特异性杀伤无影响。

Jurkat细胞TCR基因重排对BV CDR3的影响

目的探讨Jurkat细胞TCRBD2-BJ2基因重排对TCRβ链可变区互补决定区3(BVCDR3)可能产生的影响,为深入研究TCR基因重排奠定实验基础。方法RT-PCR扩增TCRBV26个亚家族CDR3区,结合TCR基因扫描(GeneScan)和基因测序技术,监测Jurkat细胞在增殖传代过程中以及在T细胞激活剂和超抗原SEA等刺激诱导后TCRBVCDR3谱系漂移及长度和序列变化。结果表达TCRBV8家族的单克隆细胞株Jurkat,在增殖传代过程中,以及经刺激诱导48或72h后,未监测到有TCRBV8以外的新的BV亚家族出现,BV8CDR3长度和一级核苷酸序列也未发生变化。结论Jurkat细胞发生的TCR基因重排可能不引起TCRBVCDR3改变,因而对TCRBVCDR3区抗原识别特异性(即抗原特异性漂移)并未产生影响,但并不排除TCR发生改变的可能性。

免疫组库测序分析新生儿脓毒症患者外周血T细胞受体β链CDR3的多样性

目的采用免疫组库测序的方法分析新生儿脓毒症患者外周血T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链互补决定区3 (complementarity determining region 3,CDR3)的多样性,探讨新生儿脓毒症的可能发病机制。方法 12例新生儿脓毒症确诊患儿为病例组,9例胎龄、出生体重及日龄相匹配的健康足月儿为对照组。采用Omega公司核酸纯化试剂盒(SQ Blood DNA Kit Ⅱ)从外周血样品中提取DNA,对TCRβ链CDR3进行多重PCR扩增,然后对产物进行高通量测序,分析其TCRβ链CDR3多样性及表达的差异。结果病例组和对照组的TCRβ链CDR3长度和类型相似,且均呈高斯分布。采用D50和香农-威纳指数作为多样性的评价指标,显示病例组TCRβ链CDR3多样性低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。针对TCRβ链V片段48个基因的使用频率进行比较,其中TRBV10-3、TRBV2和TRBV20-1的使用频率病例组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);对TCRβ链J片段13个基因的使用频率进行比较,其中TRBJ2-3、TRBJ2-5和TRBJ2-7的使用频率病例组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论新生儿脓毒症患者外周血TCRβ链CDR3多样性发生了明显改变,提示这可能与新生儿脓毒症的免疫发病机制有关。

采用荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCR alpha链CDR3谱系漂移技术的初步探讨

目的:初步探讨荧光定量PCR溶解曲线分析技术监测人外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法:提取4例正常人、2例淋巴瘤型白血病患者PBMC中的总RNA,逆转录成cDNA,以32个人TCRalpha链胚系可变区基因家族(TRAV)设计上游引物,共同的TCRalpha胚系链恒定区基因家族(TRAC)设计下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增32个TRAV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果:正常人外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的溶解曲线谱型图(melting curve spectratyping)呈现熔点不同的CDR3多态性,为多克隆增生的高斯分布,2例淋巴瘤型白血病患者外周血T细胞TCRalpha链32个家族CDR3表达频率不一致,部分家族呈缺失状态,患者各家族PCR产物的溶解曲线谱型图上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论:荧光定量PCR溶解曲线分析TCRalpha链CDR3谱系漂移技术方法稳定简便,能较好地监测正常人和临床样本外周血T细胞TCRalpha链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。

HBsAg、HBsAb双阳性HBV感染者TCR β链CDR3克隆型分析

目的分析HBsAg和HBsAb双阳性乙型肝炎患者与其他HBV感染者间T细胞受体(TCR)组库β链互补决定区3(CDR3)克隆型差异性。方法以11例HBsAg和HBsAb双阳性乙型肝炎患者为病例组,10例自然痊愈(HBsAb^+)者为对照组1,10例HBsAg阳性但HBsAb阴性乙型肝炎患者为对照组2。用Illumina HiseqX10测序仪对全血DNA的CDR3序列进行高通量测序,建立CDR3免疫组库,并进行CDR3克隆型及多样性分析。结果病例组任意两样本CDR3克隆型重叠率为6.28%(0.25%,13.10%);对照组1为10.49%(6.20%,17.30%);对照组2为2.60%(0.13%,13.69%),病例组与对照组1相比差异有统计学意义(P=0.008),对照组1与对照组2组相比差异有统计学意义(P=0.001),病例组与对照组2相比差异无统计学意义。经过病例组与2个对照组分别比较得到:克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1频率病例组高于对照组1(P=0.029),克隆型TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7频率病例组低于对照组1(P=0.031)。病例组与对照组1相比,V基因型TRBV5-8频率差异有统计学意义(P=0.047);病例组与对照组2之间,有14种克隆型频率差异有统计学意义,V基因型TRBV28频率差异有统计学意义(P=0.028)。3组样本的TCRβ链CDR3多样性差异无统计学意义(P>0.05)。结论克隆型TRBV7-2/TRBD1/TRBJ2-1和TRBV7-3/TRBD1/TRBJ2-7,V基因型TRBV5-8可能与HBsAg和HBsAb双阳性相关,而TCRβ链CDR3多样性与HBsAg和HBsAb双阳性无明显关系。

寻常型天疱疮患者外周血T细胞受体β链可变区CDR3基因克隆谱型分析

目的:探讨寻常型天疱疮(PV)患者外周血T细胞受体(TCR)互补决定区(CDR3)基因谱型变化,了解克隆扩增的T细胞与自身免疫性疾病的相互关系。方法:采用免疫扫描谱型分析技术,分析6例正常人外周血单个核细胞TCRβ链可变区(BV)CDR3谱型分布特征以及6例PV患者CDR3谱型变化情况。结果:6例正常人TCRBVCDR3谱型均符合正态分布,6例PV患者TCRBVCDR3谱型均出现多态性降低,BV亚家族单/寡克隆增生。结论:PV患者外周血TCR可变区β链CDR3谱型异常可能与PV发病有关。

强直性脊柱炎患者外周血TCR Vα CDR3谱系基因扫描分析研究

目的:探讨强直性脊柱炎(AS)患者外周血T细胞受体α链可变区互补决定区3(TCR Vα CDR3)谱系多态性,为AS的免疫发病机制的研究提供实验基础。方法:采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增34个TCR Vα亚家族,经免疫扫描谱型技术分析AS患者外周血单个核细胞(PBMC)中T细胞TCR Vα CDR3的谱系漂移情况。结果:5例正常健康对照PB-MC TCR Vα CDR3谱型多数呈高斯分布。所有AS患者外周血T细胞均出现多个TCR Vα亚家族谱型的异常改变,异常峰型包括:单峰、寡峰/寡峰趋势、偏峰和不规则异常峰型。34个TCR Vα亚家族中,共有17个亚家族在少数患者中的扫描谱型呈单峰即单克隆增生。结论:AS患者PBMC TCR Vα CDR3谱系具有显著多态性,表明T细胞在AS免疫发病机理中扮演重要角色。单/寡克隆增生的T细胞有可能是AS发病中的自身反应性T细胞,将为AS的发病机制的进一步研究提供基础依据。

乳腺癌淋巴结微转移患者克隆性T细胞TCRα链CDR3谱型分析

目的分析乳腺癌微转移淋巴结T细胞克隆性增生及TCRα链谱型偏移情况,了解抗肿瘤T细胞克隆的分子特征。方法利用RT-PCR扩增10例乳腺癌微转移淋巴结T细胞32个TCR可变区(AV)亚家族的基因,基因扫描检测T细胞克隆性及TCR AV亚家族取用情况,对单克隆家族行PCR扩增TCRα链全长序列,构建重组质粒后测序,分析互补决定区(CDR3)序列。结果乳腺癌淋巴结微转移患者T细胞呈单、寡克隆、寡克隆趋势和多克隆增生,不同患者表达1~4个TCR AV亚家族。克隆性T细胞的CDR3氨基酸序列不同,但是病例4和病例8含有相同的CDR3氨基酸基序:AM和DDKII。结论乳腺癌TCR AV基因表达具有多样性特点,TCR AV家族的取用可能与乳腺癌肿瘤抗原的多样性和不同个体的免疫应答反应有关。相同CDR3氨基酸基序的发现可能对乳腺癌的T细胞介导免疫治疗提供帮助。

不同HBV感染状态患者外周血CD4^+CD25^+Tregs TCR CDR3谱系漂移特征分析

目的探讨慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)及急性乙型肝炎(acute hepatitis B,AHB)这3种不同HBV感染状态下患者外周血中CD4^+ CD25^+调节性T细胞(T regulatory cells,Tregs)T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链各家族互补决定区3(complementarity-determining region 3,CDR3)谱系漂移特征。方法采集3例正常人、5例慢性HBV携带者、12例CHB及5例AHB患者外周抗凝静脉血,分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC);磁珠分选法分选CD4^+ CD25^+Tregs,提取总RNA,逆转录合成c DNA;根据TCRβ链24个可变区基因(TRBV)家族设计相应的上游引物,并在β链恒定区(BC)设计1条共用的FAM荧光标记下游引物及对照引物。PCR扩增出24个包含完整CDR3区的TRBV家族的PCR产物,电泳鉴定目的片段;PCR产物送上海基康用毛细管电泳法进行基因扫描;用Peak Scanner Software v1.0软件分析TRBV家族CDR3谱系特征。结果不同HBV感染状态下24个TRBV家族CDR3谱系图均呈现一个或者多个形态不一、数量不等的单峰、寡峰、偏峰谱型,其中一些家族表达极低或缺失,在1.5%琼脂糖凝胶电泳图上多数家族于预测范围大小处呈现1条模糊条带,部分家族出现清晰条带或无条带;对不同HBV感染者间各TRBV家族CDR3谱系偏移率进行比较发现:慢性HBV携带者中BV7谱系偏移率明显高于CHB及AHB患者(P均<0.05),CHB患者中BV15谱系偏移率明显高于慢性HBV携带者及AHB患者(P均<0.05),AHB患者中BV23谱系偏移率明显高于CHB及慢性HBV携带者(P均<0.05)。CHB患者外周血CD4^+ CD25^+Tregs TRBV家族CDR3克隆增生总体异常率与HBV DNA载量呈正相关关系(r=0.576 5,P=0.049 8)。结论部分优势利用的TRBV家族可能在感染HBV后免疫耐受以及清除病毒中发挥重要作用。

1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液TRBV-TRBJ1-1 CDR3谱型分析

目的初步分析1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液中TRBV-TRBJ1-1 CDR3谱型特征。方法提取1月龄Balb/c小鼠胸腺、脾脏、肝脏、小肠和血液样本的总RNA,逆转录成cDNA,以22条TRBV基因家族为上游引物,共同的TRBJ1-1基因为下游引物(荧光标记),PCR扩增包含完整CDR3区片断,毛细管电泳激光DNA扫描技术分析CDR3谱型的长度和多态性。结果胸腺样本毛细管电泳激光扫描图呈现标准的中间高两端低的多态性分布;各家族CDR3区最长和最短比较,多数为相差8～15个氨基酸的谱型分布。脾脏、肝脏、小肠、血液样本扫描图显示多数家族呈多态性分布,但均出现数量不等的单峰、寡峰、偏峰、低峰;多数家族表现为相差3～13个氨基酸的谱型分布,部分家族在预测大小位置无对应峰型。结论 1月龄Balb/c小鼠胸腺中基本包含TCR基因随机重排的多种克隆性T细胞;脾脏、肝脏、小肠、血液表现为单、寡、多克隆形式的T细胞分布,部分家族T细胞缺失,本实验结果可为进一步研究Balb/c小鼠的T细胞发育、分布、应答及CDR3谱型与疾病关系提供方法和基础。

重症/难治性结缔组织病患者自体外周血干细胞移植治疗前后TCRBV和CDR3的变化规律

目的探讨结缔组织病患者经造血干细胞移植后T细胞受体BV亚家族(T cell receptor BV,TCRBV)的重建规律。方法重症/难治性结缔组织病13例,其中系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)8例,类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)4例,原发性干燥综合征1例。分别于动员前、动员后、移植后第2周、1月、3月、6月、12月及18月,共8个时间窗,取外周血,通过逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和基因扫描方法,观察TCRBV和互补决定区3(complementarity determinative region3,CDR3)表达的动态演变。结果动员前的TCRBV亚家族和CDR3谱型呈一定程度的偏移性/寡克隆性表达;移植后2周,其偏移性/寡克隆性呈现一过性增强;而后再向多克隆化演变。结论移植后的TCRBV和CDR3的免疫重建具有自身反应性TCR的优势表达和CDR3的寡克隆性增殖受抑的特点,有向正常人表达类型发展的趋势。

基因扫描分析人T细胞受体CDR3谱型检测T细胞克隆技术的建立

目的建立人T细胞受体(TCR)互补决定区3(CDR3)基因谱型的基因扫描分析术,为分析T细胞克隆提供研究方法。方法分别以Jurkat和Raji细胞作为阳性和阴性对照,应用RT-PCR方法扩增5例健康志愿者外周血T细胞的34个TCR Vα亚家族和26个TCR Vβ亚家族的CDR3,并用基因扫描分析扩增产物以确定T细胞的克隆性。结果T细胞株Jurkat细胞仅表达TCR Vα1.1和Vβ8基因,且为单克隆,而B细胞株Raji细胞则不表达所有的TCR Vα和Vβ基因。5例健康人表达所有的TCR Vα和Vβ基因,均为多克隆T细胞。结论基因扫描分析人TCR CDR3基因谱型是检测T细胞克隆性的精确敏感方法。