流体剪切力作用下间隙连接蛋白Cx43在骨改建中的机制初探

目的 探讨骨细胞在受到机械流体剪切力作用后,间隙连接蛋白Cx43参与骨改建的机制。方法 将受流体剪切力作用的骨细胞分成5组,即施加生理流体剪切力组,过大流体剪切力组,siRNA干扰组,18a-GA阻断组,对照组。收集加力后系统内的循环液体作为条件培养基对单核细胞株RAW264.7和骨髓间充质干细胞MSCs进行培养,观察破骨细胞的生成和钙化结节形成情况。结果 抑制骨细胞内Cx43的表达或阻断胞间的间隙连接通路,均能导致破骨细胞诱导生成相关因子增加,促进破骨细胞生成,抑制骨髓间充质干细胞MSCs成骨向分化。结论 间隙连接蛋白Cx43作为骨细胞上的力学感应受体,能通过影响成骨、破骨活动对骨改建发挥重要的调节作用。

连接蛋白43与动脉粥样硬化的关系及干预策略的研究进展

动脉粥样硬化及机械性损伤所致新生内膜的形成机制极为复杂,随着研究的深入发现,连接蛋白43(Connexin 43)是血管细胞表达最为丰富的连接蛋白,其组成的半通道在血管病理变化的各个环节中发挥重要的调控作用。抑制Connexin 43表达活性为动脉粥样硬化的治疗提供新的策略与潜在治疗靶点。本文聚焦于Connexin43与动脉粥样硬化关系的最新研究进行综述。

乌头碱对培养新生大鼠心室肌细胞Connexin43蛋白磷酸化的影响

目的建立细胞水平的染毒模型,观察乌头碱对心肌细胞缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)的影响。方法实验分0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0μmol/L等6个不同浓度乌头碱染毒组,运用蛋白印迹法和免疫荧光技术,检测各组及对照组心肌细胞Cx43蛋白磷酸化状态的改变。结果蛋白印迹检测显示,不同浓度染毒组心肌细胞中Cx43蛋白总量与正常对照组无显著差异;0.5μmol/L乌头碱染毒后,Cx43开始出现脱磷酸化;当染毒浓度达到1.0μmol/L后,Cx43脱磷酸化显著,且1.5及2.0μmol/L染毒效果和1.0μmol/L染毒组相当。免疫荧光分析结果提示乌头碱作用后,心肌细胞Cx43蛋白在羧基端第368位点丝氨酸残基(Ser368)发生明显的脱磷酸化。结论一定浓度的乌头碱能诱导心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43发生显著脱磷酸化。

原发性肝细胞癌组织中Connexin43和CD147的表达及意义

目的探讨原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中Connexin43(Cx43)和CD147蛋白的表达及意义。方法采用免疫组化PV6000法检测74例HCC和20例正常肝组织中Cx43和CD147的表达。结果 Cx43和CD147在HCC组织中阳性率分别为27.03%、63.51%,在正常肝组织中阳性率分别为95.00%、30.00%,Cx43在正常肝组织中的阳性率明显高于HCC组织中的阳性率,差异有显著性(P<0.01);CD147在HCC组织中阳性率明显高于正常肝组织的阳性率,差异有显著性(P<0.01)。Cx43和CD147阳性表达与肝细胞癌的肿瘤大小、分化程度、TNM分期及肝内血管癌栓具有相关性(P<0.05),与患者的年龄、性别、有无伴肝硬化、门静脉癌栓及术前血清甲胎蛋白水平无相关性(P>0.05)。肝癌组织中Cx43表达下调,CD147表达上调,两者呈负相关(P<0.01)。结论联合检测HCC组织中Cx43和CD147的表达情况,可预测HCC的浸润和转移,对指导临床治疗和判断预后有重要意义。

肝癌细胞中connexin32、connexin43的表达及其与间隙连接通讯功能的相关性

目的 :研究肝细胞肝癌和正常肝细胞间隙连接蛋白connexin 32 (Cx32 )、connexin 4 3(Cx4 3)的表达 ,及其对间隙连接通讯功能 (GJIC)的影响。方法 :应用细胞培养及流式细胞分析技术 (FCM) ,研究肝癌细胞系HHCC、SMMC 772 1和正常肝细胞系QZG细胞中Cx32和Cx4 3的表达。结合LuciferYellow划痕标记荧光传输技术 (SLDT) ,检测上述细胞的间隙连接通讯功能。结果 :流式细胞仪分析证实 ,Cx32蛋白在肝癌细胞系HHCC、SMMC 772 1和正常肝细胞系QZG细胞中表达的阳性率分别为 1 9%、0 7%和 99.0 % ;Cx4 3蛋白在HHCC、SMMC 772 1和QZG细胞中表达的阳性率分别为 7 3%、2 6 5 %和 99 1%。SLDT检测发现肝癌细胞HHCC ,SMMC - 772 1的间隙连接通讯功能较正常肝细胞QZG明显减弱。结论 :Cx32、Cx4 3蛋白在正常肝细胞中具有较高水平的表达 ,在肝癌细胞中表达水平显著降低 ;肝癌细胞的间隙连接通讯功能较正常肝细胞亦明显减弱。Cx32、Cx4 3表达调控异常引起的间隙连接通讯障碍可能与肝癌的发生密切相关。

二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达的影响

目的研究二甲双胍(metformin,Met)对高糖培养下的H9c2细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)表达的影响及其机制。方法高糖培养的大鼠H9c2心肌细胞分别加入3和5μmol·L-1的两种不同浓度的二甲双胍继续培养24 h。MTT实验检测H9c2细胞活力;LDH释放实验检测细胞毒力;细胞免疫荧光实验检测Cx43的表达和分布;荧光法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot检测Cx43、pAMPK、AMPK和GAPDH的表达。结果 Met能增加H9c2细胞活力,降低细胞内ROS水平,对LDH释放差异无显著性;Met使AMPK磷酸化水平明显升高,增加心肌Cx43表达,改善Cx43的分布。结论 Met可能通过激活AMPK途径,增加心肌细胞Cx43的表达和减少细胞内ROS的产生,进而发挥心血管的保护效应。

connexin43基因体外转染大鼠L6骨骼肌成肌细胞的研究

目的将含有connexin 43基因的质粒在脂质体的介导下转染进入大鼠L6骨骼肌成肌细胞,使用G418根据有限稀释法筛选单克隆细胞株L6myoblast-Cx43。方法通过免疫细胞化学技术、Western blot技术,对整合有connexin43基因的阳性细胞克隆进行检测。结果两个阳性克隆组Cx43蛋白表达均明显高于对照组。结论获得的两个持续高表达connexin43蛋白的细胞株可用于进行移植细胞之间及移植细胞与宿主细胞之间能否形成良好的电偶联的研究。

间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达

目的 :构建携带间隙连接蛋白 connexin4 3 c DNA的真核表达载体 ,建立 connexin4 3蛋白高表达细胞株。 方法 :connexin4 3 c DNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体 p ED4 ,转染中国仓鼠卵巢 ( CHO)细胞 ,用甲氨蝶呤 ( MTX)筛选得到 connexin4 3基因高表达细胞。结果 :酶切电泳结果显示载体 p ED4 -Cx4 3按设计构建。经 MTX筛选得到不同抗性的 CHO细胞 ,免疫组织化学方法显示有 connexin4 3蛋白的表达 ,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同 MTX抗性的 CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。 结论 :利用载体 p ED4可以使 connexin4 3基因在真核细胞内表达。

间隙连接蛋白connexin43在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其与bcl-2、bax表达的相关性

目的:研究细胞间隙连接蛋白connexin43基因(Cx43)在膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder,BTCC)组织中的表达,及其与凋亡相关基因bcl-2、bax表达的相关性。方法:分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学法检测60例BTCC中Cx43 mRNA和bcl-2、bax蛋白的表达,并与癌旁组织、正常膀胱组织各15例进行对照。结果:60例BTCC组织中Cx43 mRNA的表达率为43.33%,显著低于癌旁组织和正常膀胱组织的表达率73.33%及100%(χ2=17.58,P<0.01)。Cx43的表达与肿瘤的病理分级和淋巴转移均呈显著负相关(χ2=9.33和9.74,P均<0.01),而与患者性别、年龄、临床分期、肿瘤直径和肿瘤生长方式等均无相关性(P均>0.05)。相关性检验表明Cx43与bcl-2蛋白表达呈显著负相关(r=-0.63,P<0.01),而与bax蛋白表达则呈正相关(r=0.52,P<0.01)。结论:Cx43在BTCC组织中的表达下调提示其与膀胱癌的发生发展和侵袭转移密切相关,可作为判断其预后的重要参考指标。Cx43基因可能与凋亡相关基因bcl-2、bax在膀胱移行细胞癌的发生发展中分别起拮抗和协同作用。

Connexin43与心肌缺血相关性研究

目的探讨Cx43在急性心肌缺血时缺血时间与表达量的相关性。方法结扎兔左冠状动脉造成急性心肌缺血模型,于结扎后不同时间取左心室前壁心肌。用HBFP染色定位心肌缺血区域,以SP法显示Cx43的表达,通过图像分析系统分析采集IOD值,分析不同时间急性心肌缺血与Cx43的IOD值。结果急性心肌缺血时间与Cx43的表达呈负相关。即随着缺血时间延长,缺血面积增加,Cx43的表达呈下降趋势,两者相关性有统计学意义。结论兔心肌Cx43的表达,与缺血时间呈负相关。

Connexin43介导的缝隙连接与心血管疾病研究进展

半通道蛋白Connexin(Cx)是一种跨膜蛋白,通常以六聚体形式在细胞膜的特定区域形成缝隙连接通道,允许小分子物质通过。心血管系统内有多种Cx蛋白表达,其中Cx43表达最为广泛,由Cx43组成的缝隙连接介导心肌细胞间电化学信号传递和物质交换,在维持正常心脏功能中起着重要的作用。近年来文献报道,Cx43结构、数量或其分布的变异与多种心血管疾病有关,如先天性心脏病、肥厚型心脏病、心律失常、高血压以及心力衰竭等。因此,该文对Cx43与心血管疾病关系作一综述。

Cx43在神经管畸形发生中神经上皮的表达及意义

目的观察缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)在神经管畸形(neural tube defects,NTDs)发生中神经上皮的表达,以探讨Cx43与NTDs发生的关系。方法用过量RA建立小鼠胚胎NTDs模型。用SABC免疫组化方法和图像处理系统,分析比较实验组和对照组神经管发育情况以及Cx43蛋白表达的位置和强度。结果对照组神经管发育良好并适时闭合,实验组神经管发育不良而且不能闭合,脑泡不能发育;Cx43蛋白表达于神经上皮细胞的细胞膜和细胞质内,而且实验组明显高于对照组(P<0.05);Cx43蛋白的表达表现出时间的差异性。结论Cx43蛋白定位于神经管上皮细胞的胞膜和胞质内,且有时间差异性。Cx43蛋白的过高表达可能与RA致NTDs密切相关。

高钾和(或)谷氨酸对培养的星形胶质细胞Connexin43表达的影响

研究高浓度钾和 (或 )谷氨酸对星形胶质细胞缝隙连接蛋白表达的影响。利用培养的星形胶质细胞 ,用免疫细胞化学方法 ,观察connexin4 3(Cx4 3)表达的变化。结果 :单独给予氯化钾 (2 5mmol/L ,× 10min)或谷氨酸 (4 0 0 μmol/L ,× 2 0min) ,刺激后 8hCx4 3的表达较对照组增高 (P <0 .0 1) ,2 4h恢复正常 ;同时给予氯化钾 (2 5mmol/L)和谷氨酸 (4 0 0 μmol/L ,× 10min) ,刺激后 8hCx4 3的表达开始较对照组增高(P <0 .0 1) ,且随时间逐渐增高 ,于 4 8h达高峰。以上结果提示 :细胞外高浓度钾和 (或 )谷氨酸在一定时间内可引起Cx4 3表达上调 。

大鼠脊髓损伤后逼尿肌兴奋性改变及Connexin43表达的研究

目的探讨大鼠不同平面脊髓损伤(SCI)造成神经源性膀胱后尿动力学,逼尿肌兴奋性改变和Con-nexin43(Cx43)的表达情况。方法成年健康SD雌性大鼠52只,将其随机分为对照组、骶上脊髓损伤(DH)组、骶下脊髓损伤(DA)组。采用脊横断法制备大鼠神经源性膀胱模型。4周后行尿流动力学检查,膀胱离体逼尿肌肌条兴奋性检测,免疫组化法和Western blotting检测Cx43表达情况。结果 DH组逼尿肌漏尿点压较对照组、DA组明显升高,DA组逼尿肌漏尿点压较对照组显著降低;DH组膀胱逼尿肌肌条自发性收缩的频率较对照组、DH组明显增高,DA组膀胱逼尿肌肌条自发性收缩的频率较对照组明显降低。DH组Cx43表达较对照组、DA组明显升高,DA组Cx43表达较对照组明显降低。结论尿流动力学检查为神经源性膀胱的早期诊断及选择个体化治疗方案提供了一种有效的检查手段。DH组为逼尿肌反射亢进,DA组为逼尿肌反射无力,逼尿肌反射亢进与逼尿肌收缩频率与幅度增高有关,膀胱逼尿肌Cx43表达增高可能是逼尿肌反射亢进机制之一。

间隙连接蛋白-43的表达调控及其功能

细胞间间隙连接通讯(G JIC)是相邻细胞之间的信息和能量物质交换的重要基础。作为G JIC重要成员之一的connexin43(Cx43)基因在转录和翻译水平受到机体的严密调控。相应地,除了调节G JIC外,Cx43也通过影响细胞增殖、分化和凋亡过程参与多种疾病尤其是肿瘤的发生和发展过程。

颈椎后纵韧带骨化患者韧带成纤维细胞中Cx43的表达及其在成骨化中的作用

目的：观察Connexin43（Cx43）在颈椎后纵韧带骨化患者韧带成纤维细胞中的表达,探讨其在成骨化过程中的作用。方法：选择2013年1月~12月期间在我科行颈前路手术治疗的15例颈椎后纵韧带骨化症患者（骨化组）与15例不伴后纵韧带骨化的颈椎疾病患者（非骨化组）。术中切取两组患者韧带标本并采用组织块培养法进行细胞体外培养,应用免疫细胞化学及免疫荧光技术检测胞浆内波形蛋白进行细胞鉴定。采用RT-PCR方法检测细胞内成骨特异指标骨钙素（OCN）、碱性磷酸酶（ALP）及Ⅰ型胶原（COLⅠ）mRNA表达,Western blot技术检测两组细胞Cx43蛋白表达,评估其成骨活性。采用siRNA技术对骨化组第3代细胞之Cx43抑制72h,检测抑制组与非抑制组OCN、ALP及COLⅠ的表达变化。结果：经鉴定培养出的细胞为成纤维细胞。韧带骨化组细胞OCN、ALP与COLⅠ的mRNA表达量分别为1.36±0.21、0.53±0.18、1.64±0.37,明显高于非骨化组（0.78±0.21、0.29±0.13、1.01±0.26）;骨化组Cx43蛋白表达量（1.00±0.30）亦明显高于非骨化组（0.48±0.18）。对骨化组细胞Cx43抑制72h后,其蛋白表达下调69%（P〈0.01）;非抑制组OCN、ALP及COLⅠ的mRNA表达量为1.54±0.33、1.32±0.36、1.86±0.44,抑制组分别为0.91±0.32、0.47±0.21、0.88±0.29,两组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：颈椎后纵韧带骨化症患者韧带成纤维细胞中存在较高水平的Cx43,并在其成骨化过程中发挥着积极作用。

普伐他汀对柯萨奇病毒性心肌炎小鼠Connexin43mRNA表达的影响

背景多种心律失常为病毒性心肌炎(VMC)临床表现之一。心肌细胞缝隙连接(gap junction,GJ)与心律失常密切相关,每个GJ由连接蛋白(connexin,Cx)构成。Cx43是普遍存在于心脏的工作细胞和传导系统特化细胞的连接蛋白之一。目前VMC的炎症和免疫损伤机制日益明确。炎症和之后的免疫反应损伤心肌组织,使心肌细胞膜结构改变,可以影响电传导及兴奋性。正常的GJ分布被显著破坏,Cx异常可能是VMC心律失常与电机械异常的解剖学基础。目的通过比较干预组和模型对照组小鼠的Cx43表达水平,探索普伐他汀对VMC及心律失常的作用,及不同剂量疗效的差别,并探讨其可能的作用机制。方法取66只雄性4周龄BALB／c小鼠,随机60只腹腔接种柯萨奇病毒B组3型(CVB3,10-7TCID50)0．06 mL建立VMC模型。随机等分为;模型对照组、普伐他汀40 mg·kg-1·d-1治疗组和80 mg·kg-1d-1治疗组。剩余6 R作为空白对照组,予Eagle’s液0．06 mL腹腔注射。空白对照组和模型对照组予生理盐水0．2 mL灌胃;其余组给予相应剂量的普伐他汀灌胃,每日1次。给药14 d后处死所有存活小鼠,采用实时定量PCR法检测Cx43mRNA表达水平,免疫组织化学法检测心肌胞膜上Cx43蛋白的表达。结果模型对照组心肌病变严重,心肌细胞膜上Cx43蛋白明显少于40 mg·kg-1·d-1治疗组和80 mg·kg-1·d-1治疗组。普伐他汀40 mg·kg-1·d-1治疗组(1．32±0．096)的和80 mg·kg-1·d-1治疗组(1．55±0．126)的Cx43 mPNA表达显著高于模型对照组(P值均<0．05),仍显著低于正常对照组(P值均<0．05),两用药组间的差异无统计学意义(P>0．05)。结论普伐他汀对VMC有一定的疗效,减轻了VMC时Cx43基因及蛋白表达的降低,提示他汀类药物可能是改善VMC及其心律失常的方向。

两性霉素B对急性白血病骨髓基质细胞上Cx43表达及GJIC功能的影响

目的探讨两性霉素B作用下急性白血病骨髓基质细胞上连接蛋白43(Cx43)表达及对细胞间隙连接通讯(GJIC)功能的影响。方法体外Dexter法培养13份急性白血病骨髓基质细胞(2ml/份),传代后加入两性霉素B(5×10-6mol/L)(1ml/份);采用流式细胞术及激光共聚焦显微镜检测加药前后Cx43蛋白表达的变化,采用荧光漂白恢复技术(FRAP)比较加药前后GJIC功能的差异。结果加药后急性白血病骨髓基质细胞上Cx43的表达的阳性率为(35.9±4.06)%,与加药前(38.75±3.95)%相比无明显变化但出现定位异常;加药前基质细胞的荧光强度在淬灭后缓慢恢复,而加药后基质细胞的荧光在淬灭后400s仍未恢复,GJIC功能被阻断。结论两性霉素B可影响Cx43在急性白血病骨髓基质细胞上的定位并阻断其GJIC功能。

冷刺激对乳鼠心肌细胞缝隙连接蛋白43的影响及药物干预的研究

目的:在急性冷刺激乳鼠心肌细胞模型下,评价缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)的表达及研究急性冷刺激时乳鼠心肌细胞间传导的变化及其机制。方法 :乳鼠心肌细胞原代培养,随机分为正常对照组,实验4℃组;实验0℃组;并在实验4℃组和实验0℃组分别加入100 nmol/L抗心律失常肽(APP)10,每组乳鼠8只。采用流式细胞术(FCM)分析各组细胞的凋亡率,应用聚合酶链反应(PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Cx43及其磷酸化水平在基因和蛋白上的表达。结果 :FCM结果显示:实验4℃组和实验0℃组随着冷刺激程度加强和低温时间的延长,心肌细胞的凋亡率增加;同时PCR结果显示:实验4℃组和实验0℃组Cx43 m RNA呈现不同程度的下降;Western blot结果显示:实验4℃组和实验0℃组随着刺激强度和低温时间的延长,Cx43蛋白表达亦出现不同程度的下降;磷酸化的Cx43(P-Cx43)蛋白表达亦下降,而AAP10干预后可提高两组Cx43和P-Cx43蛋白的表达。结论 :心肌细胞在急性冷刺激时Cx43在基因和蛋白水平上表达均有不同程度的下降,P-Cx43表达亦下降,而AAP10能提高Cx43和P-Cx43蛋白的表达从而改善细胞间的传导。

晚期糖基化终产物引起内皮细胞connexin43表达上调

目的研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白(gap junction protein)connexin43基因表达的影响。方法 D-葡萄糖孵育牛血清白蛋白制备糖基化牛血清白蛋白作为晚期糖基化终产物。体外常规培养的人脐静脉内皮细胞分为4组,分别为对照组,100、200和400mg/L AGEs干预组,干预24h后通过RT-PCR方法检测各组connexin43基因mRNA的表达有无差别;通过免疫荧光方法检测对照组和200mg/L AGEs干预组之间connexin43蛋白的表达水平有无差别。结果不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs干预24h均能引起人脐静脉内皮细胞con-nexin43基因mRNA的表达上调(P<0.01);200mg/L的AGEs干预24h引起人脐静脉内皮细胞connexin43基因的蛋白表达上调(P<0.01)。结论 AGEs体外短期干预可引起人脐静脉内皮细胞connexin43基因的mRNA和蛋白表达水平上调。