冬虫夏草(Cordyceps sinensis)的随机扩增多态DNA及其遗传分化

本文对来自青藏高原3个区域5个具有代表性地方的13个冬虫夏草(Cordyceps sinensis[Berk.] Sacc.)样本进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析。19个随机引物获得的RAPD谱带清晰并呈现多态,单个引物获得的RAPD片段数在3～10个之间。该19个引物在每个样本中扩增的RAPD片段总数平均约为65个。基于遗传距离分析,受试的13个冬虫夏草样本中,来自同一地方的样本间遗传差异甚微,同一区域不同地方的样本间遗传差异较大,不同区域的样本间遗传差异最大。这说明冬虫夏草地理群体间存在着遗传分化。应用UPGMA和NJ方法构建的分子系统树显示,来自5个地方的冬虫夏草实际上可以归并为显著不同的3个组,对应于样本来源的3个区域,提示RAPD标记在冬虫夏草群体中有显著的地区特异性。我们的结果还表明,冬虫夏草地理群体间的遗传差异度与地理距离呈正相关。因此,RAPD作为有效的遗传标记,可用于研究冬虫夏草的遗传多样性、起源以及系统演化等。

冬虫夏草及其近缘品中铅、镉、砷污染评价及人体健康累积风险评估方法探索

目的:对冬虫夏草及其近缘品中铅(Pb)、镉(Cd)、砷(As)的残留量进行测定,探索符合冬虫夏草及相关产品使用特点的污染评价及人体健康风险评估方法。方法:基于冬虫夏草及其近缘品中Pb、Cd、As的残留量监测数据,综合运用单因子污染指数法、尼梅罗综合指数法、金属污染指数法对冬虫夏草及其近缘品进行重金属污染评价,计算重金属日暴露量,分别采用危害指数法和更加精确的靶器官毒性剂量法对Pb、Cd、As联合暴露产生的健康风险进行累积风险评估。结果:污染评价结果说明,冬虫夏草及其近缘品中As的污染应引起关注,不同品种污染程度为冬虫夏草(繁育品)=蛹虫草<冬虫夏草(野生品)<香棒虫草<亚香棒虫草;人体健康风险评估结果表明,对于心血管和神经系统,1批冬虫夏草(野生品)全草中Pb、Cd、As联合暴露产生的累积健康风险需被进一步关注。结论:冬虫夏草及其近缘品重金属污染评价,以及人体健康风险评估方法,可为中药安全性评价及相关限量标准的制修订提供参考。

一种特殊虫草与冬虫夏草的表型和DNA条形码特征比较分析及鉴别方法研究

目的:通过对子座和虫体部分进行表型与DNA条形码序列分析,探讨一种发现于四川的特殊冬虫夏草(以下简称特殊虫草)与常见冬虫夏草的区别。方法:体视显微镜观察虫草样品的外部特征;聚合酶链式反应(PCR)扩增得到真菌部位内转录间隔区(ITS)序列和宿主蝙蝠蛾昆虫的细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)序列;利用CodonCode Aligner和MEGA软件进行序列分析,建立邻接(NJ)系统进化树;对ITS序列进行限制性内切酶图谱分析,寻找具有鉴别意义的酶切位点,并通过PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)鉴别进行验证。结果:特殊虫草与常见冬虫夏草相比,虫体头部的颜色明显不同;子座真菌的ITS序列存在7个差异位点,虫体COⅠ序列存在56个差异位点,基于ITS序列及COⅠ序列的NJ系统进化树分析均显示,两者不能聚为一支;在两者差异区域,冬虫夏草存在1个XhoⅠ的酶切位点,因此其ITS序列的PCR产物可被限制性内切酶XhoⅠ切割为2个片段,特殊虫草不能被XhoⅠ切割,所以酶切前后的PCR产物在琼脂糖凝胶图上没有变化,通过该方法可对两者进行鉴别。结论:发现了一种特殊虫草,其与常见冬虫夏草的真菌子座和宿主蝙蝠蛾昆虫部分均有明显不同,并为鉴别两者提供了有效方法。

青海省冬虫夏草蕴藏量及产地适宜性区划分析系统的设计与实现

目的:预测青海省冬虫夏草产区资源蕴藏量和产地适宜性区划分析,设计“青海省冬虫夏草蕴藏量及产地适宜性区划分析系统”。方法:基于地理信息技术的组件式开发方式,以最大信息熵模型和青海省冬虫夏草蕴藏量的核心算法搭建C/S架构分析系统。结果:形成了以冬虫夏草采样点的空间分布和密度数据为依据,以生态环境因子库为基础,能够对冬虫夏草进行多维度、定量化、空间化分析的“青海省冬虫夏草蕴藏量及产地适宜性区划分析系统”。结论:建立的分析系统可预测青海省冬虫夏草的资源蕴藏量,并对青海省冬虫夏草进行产地适宜性区划分析。

基于高通量测序的人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化转录组分析

目的:探索人工培殖冬虫夏草Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.外观品质形成的分子基础。方法:以重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫为材料,利用Illumina Hiseq 2500高通量测序技术进行转录组测序分析,基于差异倍数(FC)和错误发现率(FDR)筛选差异表达基因,具体筛选条件为|log2FC|>1、FDR<0.05。结果:共获得21942个转录本,利用DEGSeq筛选获得1575个差异表达基因,其中上调表达基因626个、下调表达基因949个;基因本体(GO)数据库和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析结果显示,这些差异表达基因主要集中于氨基酸代谢、折叠-分选-降解、糖代谢、转运和分解代谢、辅酶因子和微生物代谢等途径;筛选到66个颜色变化差异表达基因,包含46个氧化还原酶活性相关基因、12个过氧化物酶体相关基因、3个单加氧酶活性调节相关基因、3个黑化反应相关基因、2个活性氧代谢相关基因,其中tyr1、TYR基因可能是冬虫夏草僵虫颜色变化的关键功能基因。结论:利用高通量测序技术和生物信息分析获得了人工培殖冬虫夏草僵虫转录组信息特征,为阐明人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化的调控机制研究提供参考。

冬虫夏草与虫草菌丝体的研究进展与前景

冬虫夏草属麦角菌科虫草属真菌类,是冬虫夏草菌寄生于蝙蝠蛾幼虫体内而产生的子座及其寄主幼虫尸体的复合物。天然冬虫夏草味甘性平,甘平质润,作用平和,补益肾肺,其功效缓和、滋而不腻,具有很好的益补作用。本文就冬虫夏草生长特性、产生过程、其寄主蝙蝠蛾、冬虫夏草无性型、冬虫夏草的主要化学成分及药理作用、人工培育与发酵等进行阐述,探讨用低成本高药效性的虫草菌丝发酵产物替代昂贵的天然冬虫夏草的可行性,以期为研发工作提供参考。

冬虫夏草抗肿瘤作用研究进展

综述冬虫夏草抗肿瘤作用及化学成分的研究进展 ,分析了冬虫夏草抗肿瘤活性成分及其作用机制。

毛细管区带电泳法测定冬虫夏草中的腺苷、腺嘌呤和尿嘧啶

建立了毛细管区带电泳法测定天然和人工冬虫夏草中腺苷、腺嘌呤和尿嘧啶含量的分析方法。采用15mmol L硼砂 +14mmol L磷酸二氢钠 +5 %(V V)甲醇 (pH =9.5 )作为缓冲体系 ,在电压为 18kV和检测波长为 2 5 4nm的条件下 ,冬虫夏草提取液中的腺苷、腺嘌呤和尿嘧啶实现了基线分离。定量分析表明 ,3种成分的校正峰面积与质量浓度呈较好的线性关系 (r≥ 0 .9991)。考察了缓冲溶液的pH值、浓度及有机改性剂对腺苷、腺嘌呤和尿嘧啶迁移行为的影响。

冬虫夏草人工培殖的研究概况

概述了冬虫夏草菌种的繁殖、虫种的繁育、菌和虫的结合以及冬虫夏草代用品的研究现状;探讨了人工培殖冬虫夏草2种模式的优、缺点;提出了目前冬虫夏草人工培殖存在的问题和未来的发展方向,以期为研究冬虫夏草的人工培殖提供理论参考。

冬虫夏草和中国拟青霉对小鼠免疫性肝损伤的保护作用

目的 研究冬虫夏草 (CS)和中国拟青霉 (CN80 2 )对小鼠免疫性肝损伤的保护作用。方法 小鼠分别尾静脉注射BCG +LPS造模 ,当日ig给予CS ,CN80 2 ,每天 1次 ,连续 10d。 10d后 ,检测其血清ALT和AST活性及肝脾重量指数 ,并用硫代巴比妥酸法测定血清与肝组织中LPO含量 ,用L92 9细胞为靶细胞检测血清中TNFα的活性。结果 CS ,CN80 2 (1.0g·kg-1·d-1,10d)抑制小鼠血清ALT ,AST活性 ,降低其血清与肝组织中LPO含量 ,并减轻其增大的肝、脾重量指数 ,降低血清中的TNF水平。结论 CS ,CN80 2预防性给药对BCG

青海省冬虫夏草的遗传变异及亲缘关系的形态性状和ISSR分析

目的探讨青海省不同地区冬虫夏草的鉴定方法,并评价其遗传变异、亲缘关系及地域分布。方法利用形态性状和ISSR标记分析青海省11个县的冬虫夏草样品。结果青海省不同地区的冬虫夏草无论是形态性状还是ISSR多态性都存在很大的遗传变异。根据形态性状数据,青海省的冬虫夏草大致分成3个组,即分别产于环青海湖地区、青海中东部和南部,但仅基于形态性状来鉴定特定的冬虫夏草十分费力且不可靠。根据ISSR指纹图谱能够鉴定不同产地的冬虫夏草,而且ISSR分析表明青海省的冬虫夏草可分成产于环青海湖地区和其他地区两大类,其他地区一大类又可分成青海省南部、中部和东部产区3个平行分支。结论青海省的冬虫夏草在分布上表现出明显的地域性。ISSR分子标记对于冬虫夏草的鉴定和亲缘关系检测是非常有效的手段,与形态性状分布相结合效果更佳。

比色法测定冬虫夏草中甘露醇的含量

比较了测定冬虫夏草中甘露醇含量的两种方法。发现天然虫草和不同品种人工虫草制成品（胶囊剂）用容量法（Ａ）测得的甘露醇含量比用比色法（Ｂ）测得的甘露醇含量要高，但天然虫草Ａ／Ｂ比值较为接近，而不同品种人工虫草制成品（胶囊剂）的 Ａ／Ｂ比值波动较大。认为用比色法测定虫草中甘露醇含量较容量法更具特异性且快速简便。

康定冬虫夏草与人工虫草的RAPD指纹图谱比较研究

目的用RAPD方法对康定虫夏、人工虫草及虫草发酵菌丝体进行指纹图谱的研究,为不同虫草的品质和药效差异提供分子依据。方法从65个随机引物中筛选出7个引物,以这7个引物进行PCR扩增,电泳得到其指纹图谱。结果没有发现任何两个样本拥有完全相同的RAPD标记,康定冬虫夏草和人工虫草具有较高的遗传多态性,而与虫草发酵菌丝体相比差异较大。结论来自不同产地冬虫夏草群体均表现出其独特的RAPD标记,其差异可能系虫体的不同所致。随机扩增的DNA片段的差异是否预示其药效的不同,有待进一步研究。

发酵虫草菌粉中甘露醇含量的比色法测定

目的 对比研究发酵虫草菌粉中甘露醇的提取和后处理方法，建立甘露醇含量的比色测定法。方法 采用超声提取、高速离心分离进行样品预处理，比色法测定发酵虫草菌粉中甘露醇的含量。结果 甘露醇的线性范围为20～90μg／mL，加样回收率为102．6％，RSD为1．34％。重复性实验的RSD为0．44％，供试品溶液在24h内稳定。2001年生产的发酵虫草菌粉中甘露醇含量的平均值比前2年约高2％，含量变化范围比前两年稍小，3年内生产的各批次甘露醇含量波动均在10％左右，发酵虫草菌粉质量较为稳定。结论 用超声离心比色法测定甘露醇含量，简捷快速，重现性好，回收率高，可以用于发酵虫草菌粉的质量控制。

冬虫夏草中核苷类成分含量测定及HPLC指纹图谱研究

目的:建立冬虫夏草中尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷4种核苷类成分含量测定及HPLC指纹图谱分析的方法。方法:采用Grace Prevail C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为水-甲醇,梯度洗脱,流速1.0 m L/min,检测波长260 nm,柱温25℃。结果:测定了不同产地冬虫夏草药材中4种核苷类成分的含量,并建立了该药材的HPLC指纹图谱,在指纹图谱中共有13个共有峰,并指认了尿苷、肌苷、鸟苷和腺苷,指纹图谱的相似度均大于0.95,各色谱峰分离效果良好,符合指纹图谱要求。10个不同产地冬虫夏草样品指纹图谱的聚类分析和主成分分析结果相似。结论:该方法较好的反映了冬虫夏草药材中的化学成分信息,重复性好,样品间的相似性良好,说明这一药材所含的核苷类化学成分分布及比例较稳定。将指纹图谱与主成分分析、聚类分析运用于不同来源冬虫夏草的质量鉴别,可为药材特征评价方法的建立提供依据。

冬虫夏草及其类似品的HPLC指纹特征分析

目的:研究冬虫夏草及其类似品的HPLC指纹特征分析方法。方法:对冬虫夏草及其类似品共13个样本进行HPLC测定,结果分别采用相似度评价和采用轮廓图、雷达图、星座图等方法进行多变量二维平面比对分析。结果:相似度分析可综合量化样本的相似程度,轮廓图、雷达图、星座图等图示则能直观展示品种间的分类和特点。结论:相似度分析和轮廓图、雷达图、星座图等多变量图示的综合应用更加有利于指纹图谱的评判和指纹特征解析。

冬虫夏草菌的动态产孢量及抗异能力

目的 研究冬虫夏草菌的生长速度和动态产孢量 ,揭示产孢规律和条件 ,探索人工繁殖的可能及评估其在对虫害生物防治中的应用潜力 ;测定它的抗异活性和抗菌谱 ,为对其活性产物的性质研究打下基础。方法 测量虫草菌株在真菌培养基生长时的菌落直径变化 ,用孢子计数法跟踪测定普通培养基和水琼脂上单菌落的动态产孢量并与相近虫草菌进行对比分析 ,用琼脂块法测定培养菌丝对致敏菌的抗异活性 ,测量比较抗菌圈大小和总结抗菌谱。结果 在 PDA等 3种常规真菌培养基上 ,CY- 82 0 2的菌落扩展与时间呈线性关系。动态产孢量的测定表明 ,该菌株在适宜培养基上的单菌落产孢量可达 10 7以上 ,并随着时间的延长而增长 ,大约 2 0 0 h后增长趋于平缓。对2 2个致敏菌株的抗菌实验显示 ,CY- 82 0 2培养菌丝对革兰氏阳性的枯草杆菌、四联球菌、白色葡萄球菌以及革兰氏阴性的普通变形杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌和沙门氏菌等 7株细菌有较强的抑制能力 ,对 3株霉菌和 1株放线菌有轻微抑制 ,对酵母菌未见抑制影响。结论 虫草菌丝的生长和产孢力是有效侵染寄主的两个重要因素 ,但菌丝生长速度不宜作为生长力强弱的唯一判断指标 ,菌丝的穿透力更加重要 ;具有超量产孢能力是虫草菌株强侵染力的一个重要标志。抗异活性表明冬虫夏?

滇西北地区冬虫夏草和阔孢虫草的遗传分化研究

应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对来自云南西北部高黎贡山和丽江玉龙雪山的6个冬虫夏草Cordycepssinensis（Berk．）Sacc．，来自德钦地区三个地方的8个阔孢虫草C.crassisporaZang，YangetLi以及来自云南昆明的一个蛹虫草C.militaris（Vuill）Fr．进行分析。18个随机引物获得的RAPD谱带清晰并呈现多态。遗传距离分析表明，冬虫夏草／阔孢虫草与蛹虫草之间存在显著的遗传差异。冬虫夏草与阔孢虫草之间的遗传差异较为明显。在同种虫草个体中，来自同一地方的样本间遗传差异较小，不同地方的样本间遗传差异较大。说明云南虫草的不同地理群体间存在遗传分化。应用UPGMA和NJ法构建的分子系统树将来自不同地方的冬虫夏草及阔孢虫草分别聚在一起，提示RAPD标记在虫草群体中有显著的地区特异性。RAPD作为有效的遗传标记，可在分子水平上研究虫草属的遗传分化、起源和系统演化等。

比色法测定冬虫夏草和蛹虫草中多糖和甘露醇的含量

应用苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法和高碘酸钠氧化法建立虫草多糖和甘露醇的定量分析方法,并比较市售天然冬虫夏草和人工栽培蛹虫草在多糖和甘露醇含量上的差异。结果发现,用比色法测定三种天然虫草和六种蛹虫草中多糖和甘露醇的含量,其多糖平均加样回收率分别为:94.7%(RSD为2.29%),甘露醇的含量平均加样回收率为98.8%(RSD为1.79%)。实验表明,本研究方法可用于虫草多糖和甘露醇的定量分析。

近红外技术测定冬虫夏草中氨基酸含量

目的:尝试建立快速无污染的测定冬虫夏草中总氨基酸及主要氨基酸含量的方法。方法:样品粉末采用近红外光谱仪测定其近红外光谱,以 TQ 分析处理软件对样品粉末近红外结果进行建模,利用该模型和所测得的近红外光谱可快速、无污染、准确地得到样品的氨基酸含量。结果:该法得到的相关系数令人满意,可快速简便地达到测定冬虫夏草中氨基酸含量的目的。结论:本法快捷、准确,无污染且不损失样品,值得在药物检验中推广。