伞房属CCR基因PCR优化体系建立及多拷贝的发现和分析

对伞房属CCR基因进行扩增,对影响PCR的条件进行优化,结果筛选出引物对A-3198适宜的PCR循环条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,60℃退火lmin,72℃延伸2min,运行30个循环;最后72℃后延伸7min。对伞房属树种进行PCR扩增时,发现用同一引物对,一个样本可以扩增出不同长度的条带。将目的片段进行克隆测序,得到6个序列。所分析的基因片段从Exon3-Exon5,其中Exon3变异位点具有3个,Intron3无变异位点;Exon4变异位点具有7个,Intron4变异位点最多,达到276个,Exon5变异位点也只有6个。从变异位点所占百分数分析,所有外显子包括Exon3、Exon4和Exon5,变异数百分率很低,从1.67%-1.98%,说明外显子是相对保守和稳定的。Intron3最稳定,无任何差异位点。Intron4差异最大,差异百分数高达,19.99%。在Intron4有4处插入发生。第1处插入发生在第2041-2067,插入27个碱基。第2处插入发生在第2127-2289,插入163个碱基。第3处插入为PolyA,6个样本都存在PolyA。第4处为SSR序列。在外显子上未发现2个或2个以上碱基的插入/缺失。从氨基酸的变异来分析,所发生的核苷酸变异很多是无义突变,只有Exon3的2个氨基酸、Exon4的3个氨基酸,以及Exon5的2个氨基酸发生有义突变。本试验于国内外首次发现伞房属树种CCR基因具有多拷贝现象,而在桉树另外2个属桉属和杯果木属的CCR研究中未曾发现。