含CpG motifs的乙肝表面抗原载体的构建及表达(英文)

构建了编码乙肝表面抗原中蛋白的卡那霉素抗性真核表达质粒 pVAX_CpGS2 S ,其中通过PCR克隆了若干个CpGmotifs到质粒载体中 .经酶切鉴定和测序正确后将重组质粒体外转染COS7细胞 ,ELISA法检测上清液中的HBsAg呈阳性 ,说明重组质粒 pVAX_CpGS2 S在体外能够有效表达HBsAg ,为探讨CpGmotifs克隆入DNA疫苗载体后对体内免疫反应的影响打下基础 .

体外筛选对鸡具有免疫刺激活性的CpG寡脱氧核苷酸

分别用有丝分裂原和CpG寡脱氧核苷酸 (CpGODN)对SPF鸡全血 ,经低速离心分离的外周血单个核细胞(PBMC)和脾脏细胞 ,用淋巴细胞分离液分离的PBMC和脾脏细胞进行刺激 ,用3 H TdR掺入法测定并比较上述鸡免疫细胞在不同培养温度和细胞浓度下的转化效果 ,从而建立了适用于大批量筛选对鸡具有免疫刺激活性CpGODN的淋巴细胞转化方法。进一步用该方法筛选自行设计合成的 38条ODN。结果表明 ,用低速离心法分离的鸡PBMC ,在细胞含量为10 7mL-1、 37℃、 5 %CO2 条件下 ,经CpGODN刺激 6 4～ 6 6h后 ,可以得到稳定的高效转化 ;不含CpG模体的ODN不具有免疫刺激活性 ;CpGODN 10、 11和 14具有最佳的免疫刺激活性 ,刺激指数大于 10。

不同剂量CpG序列对仔猪的免疫增强效果

以伪狂犬病毒为模式病毒,按照仔猪体质量分别将100、10、1μg/kgCpG序列同猪伪狂犬疫苗联合免疫接种仔猪,检测仔猪的体液及细胞免疫反应.试验结果表明:不同浓度的CpG序列均能显著提高仔猪的特异性抗体滴度、白细胞介素(IL) 2诱生活性以及淋巴细胞增殖反应,证明CpG序列能显著增强仔猪对常规疫苗的免疫应答能力.

CpG序列和猪白细胞介素6基因转染表达对猪囊尾蚴基因疫苗免疫影响的研究

以猪囊尾蚴VTS76抗原基因和质粒VPIL 6、pUCl8 CpG免疫接种小鼠 ,检测了小鼠的体液及细胞免疫反应。结果发现 ,VPIL 6或pUC CpG与VTS76共同免疫小鼠的特异性抗体滴度、IgG含量、淋巴细胞白细胞介素 2诱生活性、脾细胞增殖反应和血液免疫细胞数量显著高于VTS76免疫组和对照组。证明VPIL 6和CpG序列能显著增强动物对DNA疫苗的细胞和体液免疫反应 。

CpG序列及阳离子脂质体对猪带绦虫抗原基因免疫应答的影响

本实验将猪带绦虫抗原基因VTS76分别与pUC1 8质粒、重组pUC1 8 CpG质粒联合及阳离子脂质体包装后免疫小鼠。结果表明 :pUC1 8和 pUC1 8 CpG能显著提高免疫小鼠总IgG和特异性抗体水平 ,增加小鼠免疫细胞数量 ,增强淋巴细胞增殖活性及白细胞介素 2的诱生活性。其中 ,pUC1 8 CpG的免疫增强效果更显著。阳离子脂质体包裹具有减少质粒用量。

猪白细胞介素4,6融合基因和CpG基序对猪蓝耳病疫苗免疫的强化效应

为探索新型高效安全的猪蓝耳病疫苗免疫佐剂,本实验用离子交联法制备壳聚糖纳米颗粒包裹猪融合基因PIL-46和CpG基序的真核表达质粒(CNP-(VRIL-46+VR1C)),将CNP-(VRIL-46+VR1C)肌注接种过猪蓝耳病灭活苗的长白川白杂交猪,接种后1、2、4、6和8周采取实验猪静脉血,用Sandwich ELISA检测血清中白细胞介素2(IL-2)、IL-4、IL-6和IgG、IgA、IgM及特异抗体的含量,同时检测外周血液免疫细胞数量的变化。结果发现实验猪接种CNP-(VRIL-46+VR1C)后1～8周内,其血清中IL-2、IL-4、IL-6和IgG、IgA、IgM及特异抗体的含量较对照组均显著增多(P<0.05),淋巴细胞和单核细胞数量也明显升高(P<0.05)。这些表明接种CNP-(VRIL-46+VR1C)的实验猪的特异体液和细胞免疫水平均显著多于对照组,提示PIL-46基因和CpG基序组合能显著增强猪的特异体液和细胞免疫机能,明显提高其免疫防御力,具有研制为高效安全的分子免疫增强剂的应用前景。

CpG-ODN对树突状细胞的分化成熟的影响

目的 :探讨CpG ODN对小鼠骨髓来源的树突状细胞 (bonemarrow deriveddendriticcells ,BMDC)分化成熟的影响。方法 :利用合成的含非甲基化CpG基序的寡核苷酸 (CpGmotifcontainingoligonucleotides,CpG ODN) ,通过酶切鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度 ,FACS分析DC表型和内吞作用的变化 ,ELISA检测DC培养上清中IL 12 ,IL 6 ,IL 1β和TNF α和NO的含量。结果 :CpG ODN能够刺激DC前体细胞增殖 ,提高DCMHCⅡ类分子、B7 2和CD40的表达 ,明显增加IL 12等细胞因子的分泌 ,显著增强DC刺激初始型T细胞增殖。结论 :CpG

BCG-CpG-DNA制备、理化特性及免疫刺激活性的初步研究

采用机械破碎、CTAB沉淀、酚:氯仿:异戊醇抽提法从卡介菌(BCG)中制备BCG-CpG-DNA,经化学方法确定其理化成分,通过双抗体夹心ELISA法检测小鼠IgM水平检测其免疫刺激活性.结果显示每克半干重的卡介菌提取BCG-CpG-DNA约0.9mg.提取物主要成分为BCG-CpG-DNA,分子量大小在3 000～15 710 bp,含少量的多糖和蛋白;紫外分光扫描在260nm有最大吸收;对特异性识别DNA长链的CCGG中的CpG位点的限制性内切酶HpaⅡ高度敏感;能够活化小鼠B细胞产生IgM.所制备的BCG-CpG-DNA含较多的未甲基化CpG基序,具有免疫刺激活性功能.

人乳头瘤病毒11型DNA中CpG基序甲基化状态分析及生物活性的研究

目的 对人乳头瘤病毒 11型全核苷酸序列的CpG基序 (CpGmotifs)进行分析 ,为阐明尖锐湿疣的发病机制和提高DNA疫苗的效能奠定理论基础。方法 对从pBR32 2 HPV11重组质粒上酶切下来的HPV11全长DNA进行计算机分析 ,包括分类、计数和定位 ;并用限制性内切酶PCR法分析HPV11DNA中CpG基序的甲基化状态 ,即分别用甲基化敏感的限制性内切酶AccⅡ、HaeⅡ和HpaⅡ对HPV11DNA进行酶切消化 ,再以HpaⅡ切割位点侧翼序列为引物 ,以HpaⅡ酶切产物为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增HPV11DNA片断 ,并用HPV11DNA刺激表达有pCIneo TLR9的HEK2 93细胞 ,ELISA法检测TNF al pha、IFN alpha和IL 12的分泌。结果 CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤 ,“G”的侧翼为两个嘧啶 ,在HPV11中共 14个。HPV11全基因组被AccⅡ切成 2个片断、被HaeⅡ切成 3个片断、被HpaⅡ切成 5个片断 ,而且以HpaⅡ酶切产物为模板进行PCR扩增 ,未能得到相应的片断。HPV 11DNA刺激有人TLR9表达的HEK2 93细胞后能检测到TNF alpha、IFN alpha和IL 12的分泌。结论 乳头瘤病毒 11型DNA中含有GACGTT等非甲基化的CpG基序 。

拮抗细菌DNA的CpG-N ODN筛选

目的在抑制性CpG寡核苷酸(CpG-NODN)分子设计的基础上,选择部分序列加以合成并对其生物学活性进行鉴定,筛选出能够拮抗细菌DNA的CpG-NODN。方法对合成的10条CpGODN进行生物学活性的初筛和复筛,观察其自身的刺激性及其对CpG-SODN诱导的TNF-α释放的抑制作用。使用RNAstructureversion3.71预测CpGODN的二级结构及自由能,根据10条CpGODN构效关系分析结果,对CpG-NODN分子进行再设计,并从中选择11个序列进行生物活性的筛选。结果首次合成的10条CpGODN仅1条是对细菌DNA拮抗作用较弱的CpG-NODN。通过对其构效关系进行分析,推测CpGODN的生物活性可能与自由能相关。在此基础上对CpG-NODN分子进行了再设计,合成的11条CpGODN中有5条是拮抗作用较强的CpG-NODN。结论获得了6条CpG-NODN。CpGODN的生物活性可能与自由能密切相关。

人工合成免疫刺激CpG DNA联合鸡新城疫疫苗对SPF鸡免疫应答的影响

以鸡新城疫病毒为模式病毒,分别以不同浓度人工合成的免疫刺激序列CpG DNA联合鸡新城疫低毒力活疫苗免疫SPF新生小鸡,通过ELISA法检测鸡血清中抗-NDV抗体水平,并用MTT法检测淋巴细胞白介素-2诱生活性以及淋巴细胞增殖指数(SI),结果显示不同浓度的CpG DNA均能显著提高仔鸡的特异性抗体滴度、淋巴细胞白介素-2诱生活性以及淋巴细胞增殖反应,证明CpG DNA能显著增强鸡对常规疫苗的免疫应答能力。

CpG-ODN免疫学功能及其应用研究

近年来研究表明,细菌DNA与人工合成的寡核苷酸含有非甲基化的CpG基序,均能激活机体的免疫系统、诱导和增强天然免疫和获得性免疫反应,尤其显示出有效的T_(h1)型免疫佐剂效应,在某些感染性疾病、过敏性疾病和肿瘤等的防治中具有重要的应用前景。本文就近年来关于CpG-ODN的免疫学效应以及CpG-ODN在疫苗研制中的应用等问题进行综述。

CpG-DNA的功能及应用前景

在细菌及病毒的 DNA中普遍存在的以及人工合成的非甲基化的 Cp G基序能通过 Toll样受体 9能直接活化 B细胞 ,诱导其增殖并抑制其凋亡 ;能促进免疫球蛋白和 IL -6、IL -1 0以及 IL -1 2等细胞因子分泌 ;增加 MHCII类分子和 B7共刺激分子的表达 ;激活单核巨噬细胞及树突状细胞分泌各种 Th1型细胞因子和趋化因子 ;促进淋巴细胞增殖 ,诱发体液和细胞介导的免疫反应。Cp G-DNA还可以间接活化细胞毒性T细胞 ,促进 Ig G2 a及 Ig M的优势表达 ,从而转换免疫反应的类型 (Th 到 Th ) ,因此 Cp G-DNA作为一类有希望的免疫增强剂在增强疫苗免疫效果和抗感染免疫中都有潜在的应用前景。

阳离子脂质体包裹CpG对猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗免疫效应的影响

对 3组分别注射猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗 (简称三联疫苗 )、CpG +三联疫苗、阳离子脂质体包裹CpG +三联疫苗的小鼠细胞和体液免疫反应进行了比较分析。结果显示 ,阳离子脂质体包裹CpG +三联疫苗免疫小鼠脾细胞增殖反应明显增强 ,白细胞介素 2 (IL 2 )诱生活性和免疫细胞数量、血液IgG含量较仅注射三联疫苗的小鼠显著增加。说明阳离子脂质体包裹CpG能增强小鼠对三联疫苗的体液和细胞免疫应答反应 。

引入CpG基序的嗜肺军团菌lvgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达。方法采用PCR方法将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞。结果通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpG中lvgA/CpG克隆片段长为657bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合。用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达。结论本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号。

CpG 684-乙肝疫苗食蟹猴重复免疫安全性评价

目的对食蟹猴重复给予含CpG基序寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)佐剂的乙型肝炎病毒疫苗,考察该疫苗的非临床安全性,为临床设计人用剂量及监测临床不良反应提供参考依据。方法 30只食蟹猴随机分为3组:溶媒对照组、CpG 684-乙肝疫苗50μg和500μg[含50μg或500μg CpG 684+10μg乙型肝炎表面抗原(HBsAg)]组,每组雌雄各半。在第0,2,4和6周各im免疫1次,试验期间观察食蟹猴的症状和注射部位刺激性,测定体质量、摄食量、体温和心电图,进行血液学、血清生化检测、血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、抗核抗体、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)水平检测;末次免疫后3 d和4周分别对每组部分食蟹猴进行剖检,脏器称重,并采集组织样本进行组织病理学检查。结果各组食蟹猴未见异常症状、注射部位肉眼观察未见异常,CpG 500μg组雌性食蟹猴外周血单核细胞数量增加(P<0.01)。各疫苗组均可诱导食蟹猴产生一定水平的HBsAb。食蟹猴大体病理学检查未见与疫苗相关的异常变化。组织病理学检查发现,注射部位肌束间发生轻至中度炎症反应,免疫结束4周有部分恢复,未见其他与给予疫苗相关的组织病理学改变。其他检测指标均未见异常。结论 CpG 684-乙肝疫苗在给定剂量下多次免疫食蟹猴具有较好的安全性。

CpG基序对新城疫病毒DNA免疫效果的影响

为评价CpG基序对新城疫病毒(NDV)DNA免疫效果的影响,本研究将NDVF48E9株的F基因分别克隆至真核表达载体pVAX1和含有3个CpG基序的载体pVAX1-CpG中,分别命名为pV-F和pVC-F,体外表达检测结果显示,pV-F和pVC-F外源基因表达量无明显差别。将pVAX1、pVAX1-CpG、pV-F和pVC-F经腿部肌肉多点注射3周龄SPF鸡(200μg/只),2周后以相同的剂量加强免疫,二免后2周通过滴鼻以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒。抗体检测结果表明,免疫组的抗体水平与对照组相比差异显著(p<0.01),pVC-F免疫组的抗体水平高于pV-F免疫组;淋巴细胞检测结果表明,pV-F和pVC-F免疫组与对照组显著差异(p<0.01);攻毒保护率结果显示,pVC-F和pV-F组的保护率分别为60%和50%,对照组为0。以上结果表明,CpG基序对机体细胞免疫反应有一定的增强作用。

CpG基元在细菌DNA诱导小白鼠THP-1释放细胞因子中的作用

目的 探讨CpG基元在细菌DNA诱导的细胞因子释放中的作用。方法 实验前 1h经腹腔注射 60 0mg/kgD 氨基半乳糖 (D Galactoamine ,D GalN)敏化小鼠 ,采用纯化的大肠杆菌DNA(EscherichiacoliDNA ,ECDNA)、小牛胸腺DNA(CalfthymusDNA ,CTDNA)、含有CpG基元的硫代寡核苷酸 (CpG oligodeoxynucleotides ,CpGODN )和C与G序列颠倒的硫代寡核苷酸 (Non CpGODN )静脉给予小鼠 ,DNA的注射剂量为 3 0mg/kg ,ODN的剂量为 10nmol/只 ,观察ECDNA、DNA、CpGODN与CTDNA、NON CpGODN导致小鼠死亡情况的差异。体外培养THP 1细胞系 ,在THP 1细胞培养体系中加入上述制剂后 ,测定细胞因子TNF α、IL 6、IL 1β的释放情况 ,观察上述制剂诱导细胞因子释放能力的不同。 结果 ECDNA、CpGODN可诱导小鼠的死亡以及细胞因子的大量释放 ,而CTDNA、NON CpGODN则无此能力。结论 含有CpG基元的寡核苷酸具有诱导巨噬细胞大量释放细胞因子的作用 ,CpG基元在细菌DNA诱导的细胞因子释放中具有重要的作用 。

K型和D型CpG寡脱氧核苷酸对猪外周血单个核细胞免疫刺激活性的比较研究

目的:比较K、D两型CpG寡脱氧核苷酸(CpG 0DN)对猪外周血单个核细胞(PBMC)免疫刺激活性的差异.方法:用人工合成的@K型和D型两类CpG 0DN和不含CpG基元的对照0DN D48分别刺激已分离的猪PBMC,3H-TdR掺入法测定每分闪烁次数(cpm)值,计算刺激指数(SI).双抗体夹心ELISA法测定活化细胞上清中IFN-γ和IL-2表达水平.结果:D和K型CpGODN对猪PBMC增殖均具有较强刺激作用,K型的增殖效应高于D型.含'GTCGTT'基元的2006作用尤为显著,但不能有效刺激猪PBMC分泌IFN-γ和IL-2.D型刺激增殖效应低于K型,但能有效地促进猪PBMC分泌IFN-γ和IL-2.结论:K型和D型CpG 0DN在刺激猪PBMC增殖及其分泌IFN-γ、IL-2的水平有所不同.

插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的 :构建插入CpG序列和IL - 2基因的HBV重组真核表达载体。方法 :采用PCR产物直接克隆方法 ,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1+ -HBsAg ;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒 pcDNA3.1+ -S/CpG1、pcDNA3.1+ -S/CpG2、pcDNA3.1+ -S/CpG1+CpG2及IL - 2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1+ -S/IL - 2。通过脂质体基因转移技术导入Cos- 7细胞中检测其瞬间表达。结果 :通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL - 2基因和CpG序列 ,体外转染Cos- 7细胞后可见基因的表达和分泌。结论 :本实验成功构建了我们所设计的 5种重组质粒 。