CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹非特异性免疫指标的影响

细菌DNA和人工合成的含CpG基序的未甲基化寡脱氧核苷酸(ODNs)均能刺激机体的免疫反应。本研究将鱼的免疫刺激剂寡脱氧核苷酸序列ODN-1670(含1个CpG基序)和ODN-R(含1个反向CpG基序,即GpC)按1μg/kg、5μg/kg、25μg/kg的剂量对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)进行体腔注射,同时以注射0.1mL生理盐水组与未进行任何处理的空白组作为对照。在注射前(0d)和注射后第1天、3天、5天、8天对血细胞呼吸爆发活性(O2-产量)、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性进行测定。结果显示,注射25μg/kgODN-1670能显著增强实验蟹血细胞的呼吸爆发活性(P<0.05),注射1μg/kg、5μg/kg、25μg/kg剂量的ODN-1670能显著增强实验蟹血清的POD、SOD活性(P<0.05)。而注射3种剂量的ODN-R对血细胞呼吸爆发活性、POD活性和SOD活性均没有显著影响(P>0.05)。本实验结果表明,注射适量ODN-1670能增强中华绒螯蟹的非特异性免疫功能。

CpG寡核苷酸对人外周血B淋巴细胞免疫刺激作用

目的观察CpG-ODN 2006和CpG-ODN 2216对健康人外周血单个核细胞中B淋巴细胞抗原递呈相关分子MHC-I、MHC-Ⅱ及共刺激分子CD 80、CD 86表达的影响,探讨CpG-ODN对B淋巴细胞抗原递呈功能的作用。方法CpG-ODN 2006、CpG-ODN 2216与健康人PBM C共培养48 h,用流式细胞技术以CD 19-P reCP“设门”其中B淋巴细胞,检测其表面CD 69、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD 80及CD 86的表达状况,并与未加CpG-ODN组进行比较。B淋巴细胞MHC-I、MHC-Ⅱ的表达量以几何平均荧光强度表示(M F I);CD 80、CD 86的表达量以阳性细胞百分率表示。结果CpD-ODN 2006和CpG-ODN 2216均显著提高B淋巴细胞CD 69、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD 80及CD 86的表达,与未加CpG-ODN组比较有显著性差异(P<0.05)。CpG-ODN 2216使B淋巴细胞表面抗原递呈相关分子的增加量更为明显。结论CpG-ODN能够提高B淋巴细胞表面抗原递呈相关分子和共刺激分子的表达,能增强B淋巴细胞递呈抗原的能力。

含CpG基序系列猪圆环病毒核酸疫苗的构建

人工合成了系列含有1～24个长度不等、序列不同的CpG-ODN基序,经MluⅠ单酶切、连接后插入到已构建好的真核表达载体pVAX1-ORF2的骨架结构中。酶切及测序结果证实,所构建的系列载体正确,表明已经成功构建了系列含有CpG-ODN的表达ORF2编码蛋白的重组质粒pVAX1-ORF2-CpG,为进一步优化和筛选最佳猪圆环病毒核酸疫苗奠定了基础。

CpG-ODN对山羊实验性乳腺炎乳中NAGase、MPO及乳铁蛋白的影响

选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,产后第5、8天分别向左、右乳区灌注等体积的灭菌PBS和10μg.kg-1CpG-ODN(cytosine-phosphate-guanosine dinucleotides),第9天于左、右乳区经乳导管灌注大肠杆菌(2×109CFU.mL-1)和金黄色葡萄球菌(2×109CFU.mL-1)混合菌液3 mL。分别于灌注细菌前0 h,灌注后8、16、24、48和72 h采集乳样,动态监测乳中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)和髓过氧化物酶(MPO)的活力及乳铁蛋白含量变化。灌注72 h后处死动物,取乳腺组织进行组织学观察。结果显示:灌注细菌后72 h,灌注PBS的乳腺腺泡内仍有大量嗜中性粒细胞浸润,但灌注CpG-ODN的乳区已无明显细胞浸润。灌注CpG-ODN侧乳中NAGase、MPO活性均随时间变化先上升后下降,在24 h达到最大值,乳铁蛋白含量则在16 h达到最高。灌注PBS的侧乳中NAGase、MPO活性随时间变化表现出相同的规律,但NAGase峰值高于灌注CpG-ODN的一侧,MPO峰值低于灌注CpG-ODN的一侧;乳铁蛋白含量在24 h达到最大,峰值也有所升高。上述结果表明,CpG-ODN可以增强乳腺对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌联合感染诱导的山羊实验性乳腺炎的非特异性防御能力,减轻乳腺上皮细胞的损伤。

CpG-ODN对S.aureus诱导的山羊实验性乳腺炎乳腺的保护作用研究

选择同处于泌乳初期的睢宁白山羊6头,于右乳区经过乳导管灌注10μg/kgCpG-ODN,左乳区则灌入等体积的灭菌100μL0.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)作为对照,灌注后第3d按同等剂量进行二次灌注,二次灌注后第2d,分别于左右乳区经乳导管灌注3mL(2×109CFU/mL)金黄色葡萄球菌(S.aureus),于灌注细菌前(0h),灌注后8h,16h,24h,48h和72h分别收集左右乳区乳汁进行检测。临床症状观察显示,乳腺内灌注3mL(2×109CFU/mL)的S.aureus能迅速诱导山羊典型的急性乳腺炎症状。组织学观察显示感染S.aureus后72h乳腺腺泡内仍有嗜中性粒细胞(PMN)浸润,但实验乳区明显减少。乳汁S.aureus数同在感染后24h上升至最高,CpG-ODN能显著降低各个时间点乳汁细菌数。乳汁白细胞介素-6(IL-6)水平同在感染后24h上升至最高,CpG-ODN能显著提高感染后24h乳汁IL-6水平。对照和CpG-ODN处理乳区乳汁肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平分别在感染后24h和16h上升至最高,其中在感染后24h实验乳区比对照下降40.63%(P<0.05)。乳汁N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)水平同在感染后16h达最高(P<0.01),CpG-ODN能显著提高感染后8h乳汁NAGase水平。上述结果表明CpG-ODN可通过提高乳汁IL-6水平、加速并促进乳汁TNF-α的释放,从而减少了乳汁中S.aureus数量,减轻了炎症介质对细胞的损伤,对缩短炎症过程也有一定的作用,实验结果证实了CpG-ODN对S.aureus感染诱发的山羊乳腺炎的乳腺有保护作用。

CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞免疫刺激作用的初步研究

为了筛选出对猪体有免疫刺激活性的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN),设计了9种未甲基化CpG-ODN不同序列,通过人工合成,分别作用于猪外周血淋巴细胞和脾细胞,进行健康猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞体外转化试验。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测外周血淋巴细胞转化效果和脾细胞的增殖能力和代谢能力,通过测得的OD490值,计算出淋巴细胞增殖指数(SI),筛选CpG-ODN的免疫刺激作用。结果显示:9种不同序列的CpG-ODN对猪外周血淋巴细胞和脾脏免疫细胞均具有不同程度的刺激效果,其中CpG-ODN6、CpG-ODN7刺激强度极显著。为研制DNA疫苗有效的CpG-ODN免疫佐剂奠定基础。

CpG-ODN免疫增强序列的筛选

细菌DNA具有广谱的免疫刺激作用,有实验证明人工合成的CpG-ODN可以模拟细菌DNA诱发机体产生强烈的Th1型免疫应答,CpG-ODN作为一种新型的免疫佐剂已成为分子免疫学研究的热点之一。本试验将人工合成的3种CpG寡聚核苷酸序列(ATCGATATCGAT、GACGTTGACGTT、AACGTTAACGTT)分别与猪瘟弱毒疫苗联合免疫仔猪,结果证明3种CpG寡聚核苷酸序列均具有免疫增强作用,筛选出免疫增强作用最好的一种CpG寡聚核苷酸序列。

伤寒Ty21a-CpG佐剂疫苗诱导的体液免疫应答研究

目的探讨以CpG-ODN作为佐剂,对伤寒Ty21a疫苗诱导的特异性抗体应答及B细胞增殖的影响。方法分别用含CpG-ODN10μg、30μg、50μg的伤寒Ty21a疫苗于第0、14、28天灌胃免疫NLH小鼠,末次免疫后7d,分别采集各组动物血清及脾淋巴细胞。用凝集反应检测伤寒抗体效价,MTT法检测B淋巴细胞的增殖能力。结果CpG-ODN30μg组伤寒抗体效价及B细胞的增殖活性明显高于另外两个实验组和阳性对照组。结论CpG-ODN可增强伤寒Ty21a疫苗诱导的特异性抗体应答及B细胞增殖。

添加CpG ODN佐剂对鸭坦布苏弱毒活疫苗免疫效果影响研究

鸭坦布苏病毒是一种黄病毒科黄病毒属单股正链RNA病毒,可造成蛋鸭、种鸭产蛋下降,给养鸭业造成巨大经济损失的重要疾病。目前,坦布苏弱毒活疫苗是临床上有效预防该病的重要手段之一。CpG ODN作为疫苗佐剂被证实能够有效提高疫苗的免疫效果,但其对弱毒活疫苗的是否具有免疫增强的效果尚不清楚。本研究选择鸭坦布苏弱毒活疫苗FX2010-180P,以CpG ODN为免疫佐剂,在鸭体内进行免疫以及攻毒保护实验。通过检测鸭体内抗体水平、免疫保护率、组织切片来进行免疫效果的评估。结果显示,FX2010-180P免疫组鸭子在免疫后3~4 d即可产生特异性抗体,而添加CpG ODN疫苗佐剂组,免疫鸭的抗体产生时间滞后于未添加组。攻毒保护实验结果显示,两种方式免疫方式都可以保护鸭子不受坦布苏病毒野毒的感染。本研究结果显示添加CpG ODN对鸭坦布苏FX2010-180P弱毒活疫苗并不具有免疫增强的效果。

高效赤红球菌协同CpG ODN增强鸡禽流感疫苗的免疫效力

禽类疫苗存在免疫效率低、免疫持续时间短和细胞免疫刺激不足等问题,新型禽类疫苗佐剂亟待开发。作者的前期研究证实,CpG ODN具有高度的安全性以及良好的细胞和体液免疫刺激功能,然而,CpG ODN的生产和使用成本十分高昂,尚未用于禽类疫苗佐剂。为了降低成本并提升功效,基于TLR2和TLR21潜在的协同关系,本研究以禽流感疫苗为模式疫苗,探究了赤红球菌和CpG ODN协同刺激免疫的关系。通过HI试验、细胞增殖试验和相关细胞因子表达量的检测,证实了该复合佐剂具有更强大的体液免疫和细胞免疫提升功效,能提升Th 1型免疫反应,免疫保护持续时间长,同时还能增强系统和局部免疫。通过检测受体的表达量,确证了CpG ODN与赤红球菌之间存在着协同关系。此外,在CpG ODN剂量减半的复合佐剂刺激试验中,发现由于协同关系的存在,CpG ODN半剂量的复合佐剂仍具有良好的免疫刺激效果。本研究为进一步降低CpG制剂的生产和使用成本做了先行探究,为CpG制剂高效且成本可控地应用于禽类动物养殖,乃至畜牧养殖奠定了基础。

CpG-ODN对辐射所致人小肠隐窝上皮细胞微核形成的影响

研究了CpG-ODN(CpG oligonucleotides)对非免疫细胞人小肠隐窝上皮细胞(HIEC)照射后微核变化的影响。采用MTT法检测不同浓度的CpG-ODN对HIEC的细胞毒性,检测CpG-ODN预处理后的HIEC细胞在不同剂量辐射后微核率和微核细胞率的变化。结果表明,CpG-ODN在0.00-1.25μmol/L浓度范围内对细胞的存活率没有显著影响,CpG-ODN能显著降低微核率和微核细胞率。实验结果提示CpG-ODN对HIEC有较小的毒性且能减少细胞辐照后的微核形成,具有一定的辐射保护作用。

CpG ODN B对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫增强效应

目的:探究CpG ODN作为疫苗佐剂对鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫效果。方法:将CpG ODN B/P这2种类型的免疫佐剂分别与鸡新城疫重组杆状病毒载体疫苗BV-BXY-F混合后,以鼻腔免疫方式进行鸡体免疫,并进行攻毒保护实验,通过对鸡体的临床症状观察,以及检测免疫保护率、中和抗体水平、淋巴细胞增殖活性、细胞因子含量,分析各CpG ODN对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响。结果:BV-BXY-F+CpG ODN B免疫组鸡在免疫后42 d中和抗体效价最高,免疫保护率100%,中和抗体效价,sIgA、IgG、IgA、IFN-γ、IL-2、IL-4、CD4^+T细胞、CD8^+T细胞含量较BV-BXY-F+CpG ODN P组分别提高了32.08%、8.44%、13.56%、23.71%、50.20%、132.97%、39.76%、38.43%、25.99%,且差异显著(P<0.05),与单独免疫组BV-BXY-F相比分别提高了13.71%、89.39%、10.41%、21.26%、159.17%、52.71%、237.84%、80.51%、75.57%。结论:CpG ODN B对增强鸡新城疫重组杆状病毒疫苗的免疫增强效果最好。

免疫刺激剂CpG ODN在家禽疾病防控中的研究进展

CpG ODN是含一个或多个非甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸,根据其结构及生物学活性的不同,分为A、B、C、P四种类型,目前在家禽疾病防控方面的研究主要以B型CpG ODN为主,CpG ODN通过与鸡TLR-21受体结合发挥其免疫刺激活性,可用于防控鸡常见细菌性感染、病毒性感染以及球虫感染等。文章从CpG ODN的分类、作用机制、家禽疾病防控等方面进行阐述,为CpG ODN在家禽生产中的应用提供参考。

CpG ODN纳米佐剂的免疫效应及应用进展

CpG ODN是人工合成的具有非特异性免疫刺激的DNA序列,模拟细菌DNA在体内的应答过程,诱发细胞和体液免疫。CpG ODN作为新型免疫增强剂在兽医临床上的应用展现出了巨大的潜力,并在免疫学、药物学和药效学等领域备受关注。然而CpG ODN并不稳定且易被核酸酶酶解,其自身带负电荷,不易结合到细胞表面。因此,CpG ODN如何高效传递并能有效摄取成了新的挑战。纳米传递系统的研究使CpG ODN单独或协同疫苗免疫取得显著疗效,为改善CpG ODN在疫苗研究中的应用拓宽了思路。从CpG ODN纳米佐剂的作用机制、免疫活性、安全性及临床应用等方面进行综述,并对该领域未来的研究方向进行展望,为后续工作提供有益参考。

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)协同促进脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞增殖与迁移

目的探讨CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞增殖与迁移能力的影响及机制。方法使用1 mg/L LPS处理小鼠RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症细胞模型,采用CCK-8法检测CpG ODN(500 nmol/L)对LPS诱导的巨噬细胞增殖的影响,采用TranswellTM实验检测CpG ODN对细胞迁移能力的影响;采用Western blot法检测p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、胞外信号调节激酶(ERK)、核因子κBp65(NF-κB p65)的蛋白磷酸化水平,同时使用以上通路的抑制剂SB203580、SP600125、PD98059、BAY11-7082,探讨CpG ODN发挥效应的机制;采用实时定量PCR检测CpG ODN对LPS诱导产生的单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、环加氧酶2(COX2)mRNA水平的影响。结果CpG ODN协同促进LPS诱导的巨噬细胞增殖与迁移,并促进COX2、MCP-1的转录,增强JNK、ERK信号通路蛋白的磷酸化水平,并且JNK与ERK信号通路激酶抑制剂可有效降低CpG ODN的协同效应。结论CpG ODN可通过JNK与ERK途径协同促进LPS诱导的巨噬细胞增殖与迁移并促进COX2、MCP-1的转录。

Enhancement of Immunological Activity of CpG ODN by Chitosan Gene Carrier

To investigate the enhancement of immunological activity of CpG ODN by chitosan gene carrier in mice, the effect of lymphocyte proliferation was detected in mice by using MTT, the levels of IgG and cytokines （IL-2 and IL-12） in serum were measured by ELISA and peripheral blood T lymphocyte subsets CD4^＋, CD8^＋ were analyzed by flow cytometry. Our results showed that spleen lymphocytes isolated from the CS-CpG ODN group of mice showed the strongest proliferation （SI =1.551）, and the levels of IgG, IL-2 and IL-12 in serum were higher than those of other groups. Compared with the immunization with CpG ODN, the immunization with CS-CpG ODN gene carrier was more efficient in up-regulating the percentage of CD4^＋T cells and the ratio of CD4^＋/CD8^＋ of mice, It was concluded that CS gene carrier of CpG ODN was much more effective in improving immunity of CpG ODN in mice.

CpG-ODNs疫苗佐剂的研究进展

CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODNs)是一种新型免疫增强剂,大量动物实验和临床研究表明其在感染、肿瘤和过敏等疾病的预防和治疗等领域具有良好的应用前景。到目前为止,数10种含有CpGODNs的药物和疫苗进入人体临床研究,至少有1种药物和4种疫苗已进入或完成III期临床研究。本文主要从CpG-ODNs免疫刺激活性的研究历程、CpG-ODNs免疫刺激活性的复杂性、CpG-ODNs疫苗佐剂的临床前以及临床研究等方面介绍CpG-ODNs作为人用疫苗佐剂的研究进展。

纳米复合佐剂的抗肿瘤免疫调控作用及效果研究

目的:探究纳米复合佐剂在肿瘤内的免疫调控作用及抗肿瘤效果。方法:制备包载CpG的β葡聚糖纳米颗粒(CNP),体外培养小鼠骨髓来源的树突细胞(BMDC),分5组进行体外免疫处理,分别为PBS对照组、β葡聚糖组、β葡聚糖纳米载体(NP)组、CpG组和CNP组,利用流式仪分析BMDC成熟情况。将体外培养的黑色素瘤B16F10细胞接种于C57BL/6N小鼠右后肢皮下,建立肿瘤模型,第6 d挑选肿瘤大小相对一致的24只小鼠均分为4组,即PBS组、NP组、CpG组、CNP组进行治疗,后颈部皮下注射给药,共给药4次,每次间隔3 d,期间隔天测量肿瘤体积,最后一次给药后第3 d眼眶取血,测定血浆中γ干扰素(IFN-γ)浓度,处死小鼠后分离肿瘤及脾脏,流式细胞术检测瘤内浸润性T淋巴细胞比例及脾脏内T细胞比例。结果:CNP佐剂处理后BMDC成熟比例约为CpG佐剂组的2.8倍。在小鼠体内接种肿瘤15 d后,CNP治疗组肿瘤体积较其他组均减小,血浆中IFN-γ含量显著高于其他实验组,约为CpG组的1.5倍,肿瘤浸润性T淋巴细胞与其他组相比也有明显升高。结论:构建的葡聚糖-CpG纳米复合佐剂能够有效激活BMDC,改善肿瘤微环境,具有良好的体内抗肿瘤效果。

pUC18-CpG重组质粒对鸭疫里默氏菌灭活疫苗的免疫增强效应

【背景】鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)是造成禽养殖业损失的重要病原体,可引起鸭等多种禽类浆膜炎和败血症。疫苗存在反应弱、免疫原性低、使机体产生抗体水平低等问题。【目的】探究pUC18-CpG佐剂的免疫反应及保护作用,为CpG佐剂疫苗预防鸭浆膜炎提供依据。【方法】通过鸭外周血淋巴细胞增殖试验和实时荧光定量PCR试验确定最优序列。构建重组质粒pUC18-CpG,并与CpGODN进行免疫原性比较。以灭活RA-GH5为抗原,pUC18-CpG重组质粒为佐剂,分别皮下免疫雏鸭2次,检测其血清抗体滴度和细胞因子水平;以RA-GH5肌肉注射攻毒,观察组织病理学变化及免疫保护率。【结果】筛选出免疫刺激活性最佳序列CpG-3,含CpG-3的pUC18-CpG重组质粒与CpG-3的免疫原性无明显差异。与RA疫苗相比,添加pUC18-CpG重组质粒组显著提高了血清抗体滴度以及IL-2和IL-4细胞因子水平。80μg pUC18-CpG佐剂疫苗对鸭的免疫保护率为70%,20、40μg pUC18-CpG佐剂疫苗均为60%。【结论】pUC18-CpG佐剂与RA-GH5灭活疫苗联用能够引起更强的体液免疫和细胞免疫应答。