玉米籽粒突变体crk4的基因克隆与等位性分析

籽粒突变体是克隆籽粒发育关键基因并解析其遗传调控机制的重要材料。crk4(crumpled kernel 4)是育种选系过程中发现的籽粒突变体,与野生型相比,其籽粒灌浆差、粒重和发芽率显著降低。遗传分析表明该突变由单个隐性核基因控制,图位克隆将该基因定位于玉米5号染色体614 kb的物理区间内,该区间包含11个在籽粒中表达的蛋白编码基因。序列分析表明,Zm00001d017427基因的第2个外显子上存在一个由C碱基缺失造成的crk4特异的终止突变。Zm00001d017427编码金属-烟酰胺转运蛋白(Metal-nicotianamine transporter,Sh4-shrunken4/YSL2),是已报道的籽粒突变体ysl2的等位基因。等位性测验结果表明,crk4是sh4/ysl2的一个新的等位突变体。crk4的鉴定为阐明Sh4基因调控玉米籽粒发育的分子机制提供了新的种质资源。

接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的探讨接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义。方法采用免疫组化SP法,观察Crk和CrkL蛋白在上皮性卵巢癌不同临床病理指标内的表达,并与卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织进行比较。结果上皮性卵巢癌中Crk和CrkL蛋白的表达与卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、临床分期的上皮性卵巢癌Crk蛋白的表达间差异有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、临床分期的上皮性卵巢癌CrkL蛋白的表达情况间差异无统计学意义(P>0.05)。不同组织病理类型的上皮性卵巢癌Crk和CrkL蛋白的表达间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Crk和CrkL蛋白可能在上皮性卵巢癌的发生、发展中发挥某种作用,与CrkL蛋白相比,Crk蛋白的过度表达可能更直接影响着卵巢癌浸润、转移等恶性生物学行为。

接合物蛋白Crk与CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用

目的探讨接合物蛋白Crk和CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用。方法采用免疫共沉淀法检测上皮性卵巢癌细胞株MACS中Crk和CrkL蛋白与已知的与肿瘤增殖相关的上下游结合蛋白的内源性结合;用可调节性siRNA敲低MACS细胞中内源性的Crk及CrkL,观察二者对细胞生长及存活能力的影响。结果免疫共沉淀显示卵巢癌细胞株MACS中,Crk与影响细胞生长增殖的上游蛋白p130Cas及下游蛋白Sos的结合明显强于CrkL,尽管Crk与CrkL表现出部分相同的免疫原性。免疫印迹显示在加入Dox后即Crk或CrkL表达沉默被启动。Crki/CrkLi细胞中加入Dox后Crk与CrkL表达明显降低[Dox+:Crk(0.021±0.001),CrkL(0.676±0.005);Dox-:Crk(0.544±0.003),CrkL(1.282±0.007),P<0.05]。对可调节性siRNA构建之可控性Crki/CrkLi细胞的连续动态观察发现,Crki细胞表现出细胞增殖力受限仍保存生存活力,而CrkLi细胞则表现出逐渐脱壁至死亡。结论 Crk及CrkL在卵巢癌细胞MCAS的恶性增殖中扮演着不同的作用,Crk蛋白的过度表达可能直接影响着卵巢癌细胞恶性增殖,而CrkL则可能更多地参与了细胞基本生存相关的生物行为。

Crk1/2与CrkL缺失导致足细胞损伤的蛋白质组学分析

目的探讨Crk1/2与CrkL缺失导致足细胞损伤过程中胞内蛋白表达变化情况。方法利用小干扰RNA转染方法对足细胞内Crk1/2与CrkL进行单敲降及双敲降;通过非标记液相色谱串联质谱方法对Crk1/2与CrkL单敲降及双敲降的足细胞进行蛋白质组学分析;对得到的差异蛋白进行基因本体(GO)分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析;采用Western blot试验对差异蛋白进行验证。结果Crk1/2与CrkL单敲降及双敲降的足细胞与正常足细胞比较,共发现98个差异蛋白,GO分析和KEGG分析提示多数上调蛋白富集在代谢途径,多数下调蛋白富集在信号转导途径,如抑制和激活蛋白1、磷脂酰肌醇三激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶和环磷酸腺苷信号途径。经Western blot试验验证,细胞代谢相关蛋白超氧化物歧化酶2(SOD2)表达上调,信号转导相关蛋白LRP1表达上调、c-Jun表达下调,细胞骨架损伤相关蛋白TPM4表达上调、Cdc42EP1表达下调。结论Crk1/2与CrkL缺失可通过调节代谢途径及相关信号转导途径导致足细胞损伤,TPM4、SOD2、LRP1、c-Jun和Cdc42EP1参与损伤过程,具体分子机制值得进一步探讨。

miR-126在胃癌中的表达及其靶基因Crk的鉴定

目的:分析miR-126在胃癌中的表达水平并鉴定miR-126的靶基因,以阐明miR-126在胃癌发生机制中的功能。方法:采用qRT-PCR分别检测miR-126在胃癌细胞株、正常胃黏膜组织、永生化胃黏膜上皮细胞、胃癌及配对癌旁组织的表达水平,并与胃癌组织的临床病理指标进行相关性分析。采用生物信息学方法预测出miR-126的靶基因,并通过荧光素酶报告系统加以验证;采用qRT-PCR及Western印迹法检测miR-126对靶基因mRNA及蛋白质表达水平的影响。结果:qRT-PCR检测结果显示,miR-126在胃癌细胞株中的表达水平明显低于其在正常胃黏膜组织及永生化胃黏膜上皮细胞株的表达水平。miR-126在60例病人的胃癌组织中表达的水平显著低于其在配对癌旁组织中表达的水平;且胃癌组织miR-126表达水平低者,肿瘤组织体积较大,胃壁浸润较深,易发生淋巴结转移,病理分期也较晚。生物信息学分析提示Crk mRNA的3′UTR含有miR-126直接作用的靶序列,荧光素酶报告系统检测进一步验证了该靶序列,qRT-PCR及Western印迹法证实miR-126对Crk蛋白表达的调控发生在转录后水平。结论:miR-126有望成为研究胃癌的新型标志物;miR-126通过对其靶基因Crk的调控参与了胃癌的发生、发展过程。

接合物蛋白CrkⅠ在卵巢癌恶性潜能中的作用

目的证实接合物蛋白CrkⅠ在卵巢癌恶性潜能中的作用。方法采用Western blot法检测卵巢癌组织、卵巢良性肿瘤组织、正常卵巢组织中Crk和Dock180蛋白的表达;用免疫沉淀法检测3种卵巢癌细胞株中Crk与Dock180蛋白的内源性结合;用小干扰RNA敲低SKOV3细胞中内源性的Crk,检测Crk表达缺失性细胞Crk蛋白表达水平、Rac1酶活性和侵袭力的变化。结果 Dock180与CrkⅠ的表达强度呈现明显的一致性,卵巢癌组织中二者的表达均显著高于卵巢良性肿瘤组织和正常卵巢组织(P<0.05);而在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织之间未发现明显差异(P>0.05)。3个卵巢癌细胞株中Dock180主要表现出与CrkⅠ的内源性结合。和对照相比,敲低Crk基因的细胞表现出侵袭能力和Rac1酶活性明显下降(P<0.05),而敲低CrkⅠ的细胞和同时敲低CrkⅠ和CrkⅡ的细胞相比无明显差异(P>0.05)。结论卵巢癌的恶性生物学行为与Crk/Dock180/Rac1信号通路相关,其中CrkⅠ在卵巢癌中扮演着主要角色。

乳腺癌组织中Crk蛋白的表达及其临床意义

目的探讨Crk在乳腺癌中的表达及其临床意义。方法应用免疫组化方法检测Crk在125例乳腺癌和20例乳腺良性肿瘤组织中的表达,分析其与乳腺癌临床病理特征及预后的关系。结果Crk在乳腺癌组织中的阳性表达率为39.2%,明显高于在乳腺良性肿瘤中的表达(χ2=6.447,P=0.011),Crk表达与乳腺癌组织学分级(χ2=4.965,P=0.026)有关,与TNM分期(r=0.258,P=0.004)、淋巴结转移(r=0.261,P=0.004)和HER-2(r=0.287,P=0.021)呈正相关;Crk表达阳性组和阴性组的5年特异生存率分别为38.4%和63.4%,差异有统计学意义(P=0.018)。结论Crk蛋白在乳腺癌组织中表达上调,其高表达提示乳腺癌生物学恶性度较高,预后不良。对乳腺癌患者组织标本进行Crk检测,有助于指导乳腺癌患者的个体化治疗。

Crk在胃癌中的表达及其临床意义

目的:探讨接头蛋白Crk在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理因素及预后的关系。方法 :采用免疫组织化学方法检测368例胃癌病人肿瘤组织和配对癌旁组织Crk蛋白表达水平,分析其表达与临床病理因素及预后之间的关系。结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中Crk蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。其表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、浸润深度(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)密切相关。Crk蛋白表达水平越高,病人预后越差(P<0.05)。多因素分析表明,Crk蛋白是影响胃癌病人预后的独立危险因素。结论:Crk蛋白在胃癌的发生、发展中起重要作用,可作为预测胃癌预后的分子标志物。

Si(Li)谱仪测量X射线荧光谱中CrK_β谱线化学位移的探索

采用放射源２４１Ａｍ５９．６ｋｅＶγ射线分别激发金属Ｃｒ、Ｃｒ２Ｏ３和Ｋ２ＣｒＯ４，用Ｓｉ（Ｌｉ）谱仪比较测量其Ｋｘ射线的能量。实验表明Ｋ２ＣｒＯ４中ＣｒＫβ能峰相对于金属Ｃｒ有２．１２±０．２７ｅＶ的位移。

超声微泡介导miR-126通过调节CRK抑制乳腺癌细胞生长

目的:探究超声-微泡介导的miR-126通过调节CRK对乳腺癌细胞活力的影响。方法:qPCR检测miR-126在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达,并分析其表达与乳腺癌临床特征的相关性。利用超声技术制备脂质微泡以探究超声-微泡介导的miR-126对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。EdU染色、Transwell和流式细胞术分别用于检测MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和凋亡情况。qPCR和Western blot检测CRK的mRNA和蛋白水平。此外,Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、c-Caspase-3和pro-Caspase-3的蛋白水平。结果:miR-126在乳腺癌组织和细胞中表达下调。过表达miR-126抑制乳腺癌细胞活力和侵袭能力,促进细胞凋亡。超声-微泡介导的miR-126进一步增强了miR-126对乳腺癌细胞活力的抑制作用。另外,miR-126通过调节CRK从而抑制乳腺癌细胞的活力。结论:miR-126过表达可抑制乳腺癌细胞的活力,超声-微泡介导的miR-126进一步增强了miR-126对乳腺癌细胞活力的抑制作用。本研究为乳腺癌的治疗提供了新的分子靶标和治疗途径。

接头蛋白Crk与肿瘤

Crk是一种重要的细胞内信号接头蛋白,含有SH2和SH3结构域,在信号传递过程中不仅承上启下,对信号强度还有着调控作用.迄今主要发现了4种Crk分子,即v-Crk、CrkⅠ、CrkⅡ和CrkL(Crk-Like).CrkⅡ和CrkL在分子结构上具有高度同源性,但对信号分子却具有不同的偏好性,从而体现出功能差异.本文就接头蛋白Crk的结构、Crk与相互作用蛋白质的作用机制以及与肿瘤的发生发展关系进行了阐述.

拟南芥CRKs家族自抑域序列的预测

目的:以拟南芥CDPKs激酶家族为摹本,推测类结构激酶家族CRKs的自抑域。方法:以生物信息学工具phylip3.65和clustalx1.83对CDPK家族和CRK家族进行进化树构建和多重序列比对分析。结果:结果显示CDPK亚家族Ⅳ与CRK家族的相似程度很高,且自抑域序列区域非常保守。以此为依据预测了CRK家族各成员的自抑域序列。

CRK1基因缺失对白念珠菌形态、黏附、生物被膜的影响

目的研究CRK1基因缺失对白念珠菌形态、黏附、生物被膜的影响。方法显微镜下观察,计算菌丝形成率,比较CRK1基因缺失菌(Δcrk1菌)及标准菌SC5314形成菌丝的能力;建立肠黏膜模型,计算黏附率,评价CRK 1基因缺失对白念珠菌黏附的影响;MTT法及结晶紫法(CV)评价CRK 1基因缺失对白念珠菌生物被膜形成的影响。结果与SC5314相比,Δcrk 1菌分别在10%胎牛血清和RPMI-1640培养条件下形成菌丝能力均较弱,两者之间有统计学差异;Δcrk 1菌在60、90、120 min时对肠黏膜的黏附数明显少于标准菌SC5314,两者之间有统计学差异;通过MTT法、结晶紫法两种方法证实了,在经48 h培养后,Δcrk 1菌与其标准菌SC5314相比,形成生物膜的能力弱,两者之间差异有统计学差异。结论 CRK 1基因缺失影响白念珠菌菌丝二态性的转化,进而影响黏附力和生物被膜的形成。

DLC-1、FAK及p130Crk相关底物在卵巢上皮性癌中的表达及意义

目的:研究肝癌缺失基因-1(DLC-1)、粘着斑激酶(FAK)及p130Crk相关底物(p130Cas)在卵巢上皮性癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法检测正常卵巢和卵巢癌组织中DLC-1、FAK和p130Cas蛋白的表达。结果:卵巢癌组织中DLC-1蛋白表达低于正常卵巢组织(P<0.05);FAK和p130Cas蛋白的表达均高于正常卵巢组织(P<0.05)。DLC-1蛋白的低表达与卵巢癌的临床分期、腹水和淋巴结转移相关。FAK蛋白的高表达与卵巢癌的分化程度、腹水和淋巴结转移相关。p130Cas蛋白的高表达与卵巢癌的临床分期和淋巴结转移有关。卵巢癌中DLC-1与FAK和p130Cas的蛋白表达之间均呈负相关。结论:DLC-1低表达或表达缺失和FAK及p130Cas的高表达可能与卵巢癌的发生、发展有关。DLC-1和FAK及p130Cas的联合检测有助于判断卵巢癌的恶性程度。

陆地棉CRK基因家族的鉴定及其表达分析

【目的】富含半胱氨酸类受体激酶(CRK)是植物中最大的类受体激酶家族之一,在植物生长发育、激素信号传导和抗逆境胁迫中发挥重要作用。从全基因组水平鉴定陆地棉CRK基因家族并进行生物信息学和表达模式分析,为研究和利用陆地棉CRK基因家族奠定基础。【方法】从Pfam数据库下载stress-antifung结构域氨基酸序列,应用BLASTp程序搜索棉花基因组数据库,鉴定棉花CRK基因家族;利用Compute p I/Mw tool、Signal P、TMHMM Server V2.0、Wo LF POSRT等在线工具预测陆地棉CRK家族蛋白的分子量、信号肽、跨膜结构域和亚细胞定位等;用Clustal X1.8软件对棉花和拟南芥CRK蛋白质进行氨基酸序列比对,MEGA5.0分析棉花和拟南芥CRK蛋白的系统进化关系;使用TBtools制作陆地棉CRK基因家族的染色体定位、基因结构和蛋白质结构域示意图;应用植物顺式调控元件数据库Plant CARE分析棉花启动子序列;通过植物磷酸化位点数据库Plant Phos预测陆地棉CRK家族蛋白的磷酸化位点;从NCBI数据库下载RNA-Seq数据,利用转录组定量工具Kallisto计算TPM值,通过在线工具Morpheus绘制陆地棉CRK家族基因表达热图。【结果】陆地棉基因组中有70个CRK基因,分布于14条染色体,其中52个基因(74.3%)集中串联成簇分布于A6/D6、A9/D9、A10/D10染色体,且在A/D染色体组之间呈现高度共线性关系。编码302—901个氨基酸,58个蛋白质(82.9%)具有跨膜结构域,主要定位于叶绿体、质膜和胞外。磷酸化位点预测结果表明,陆地棉和拟南芥CRK有5个相同的磷酸化位点基序,包括3种丝氨酸磷酸化位点基序和2种苏氨酸磷酸化位点基序。65个陆地棉CRK基因的启动子区(92.9%)至少含有一种逆境激素响应元件,69个基因启动子区(98.6%)至少含有一种生物或非生物胁迫响应元件。根据RNA-Seq数据分析结果,陆地棉CRK基因可分为3种不同的组织表达特征类型;盐、干旱、冷、热胁迫以及接种大丽轮枝菌均可以导致部分陆地棉CRK基因表达水平的改变。Gh CRK25在根、茎、叶和胚珠中优势表达,在纤维中几乎不表达,ABA、GA3、SA、PEG-6000、氯化钠和大丽轮枝菌Vd991处理均能刺激Gh CRK25迅速上调表达。应用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)沉默Gh CRK25可导致棉花对大丽轮枝菌Vd991更为敏感。【结论】陆地棉CRK基因家族有70个成员,具有保守的基因结构和功能结构域,多样化的组织表达特征,大多数基因受激素和逆境调控。

龙眼类受体蛋白激酶CRK家族全基因组鉴定及表达调控分析

为了解龙眼富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶(cysteine-rich receptor-like kinase,CRK)家族的基本特征与功能,本研究采用生物信息学分析方法对筛选出的98个龙眼CRK基因家族的成员进行分析鉴定,包括分子进化树的构建和对蛋白结构域及其特性、启动子及其顺式作用元件、体胚发生的过程以及组织器官特异性表达的分析。结果显示:通过对龙眼和拟南芥CRK基因做进化树分析,可根据亲缘关系的远近将其分为7个亚家族;不同亚家族成员的蛋白质特性(氨基酸数量、相对分子质量、等电点、信号肽及糖基化位点)有所不同;各成员基因结构特性,启动子顺式作用元件,蛋白结构域特性等与进化树中家族成员亲缘关系的远近相关;98个CRK家族成员在体胚发生过程(NEC、EC、ICpEC、GE)以及生长发育过程中组织器官特异性表达情况有所不同,其中在非胚性愈伤组织以及幼果中表达量较高,在种子和果实中几乎未表达。此外,富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶在生物胁迫、非生物胁迫(抗病虫害、抗旱、抗寒、抗盐胁迫等)以及在植物生长发育过程中起着重要作用。

信号接头蛋白Crk在子宫颈癌组织中的表达和意义

目的:研究信号接头蛋白Crk在宫颈癌及其癌前病变组织中的表达,探讨Crk在宫颈癌发生发展中的作用。方法:采用免疫组化SP法检测20例正常宫颈组织、27例宫颈上皮内瘤样病变(Cervial intraepithelial neoplasias,CINs)和50例宫颈癌切片中Crk蛋白的表达水平。结果:Crk蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率为68%,高于CINs的40.7%和正常宫颈组织的10%,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论:Crk可能在宫颈癌的生长、侵润及转移过程中起重要作用,有望作为反映宫颈癌恶性潜能的新指标。

联合检测血清和胸腔积液Crk样蛋白、CEA在恶性胸腔积液诊断中的价值

目的评价联合检测血清和胸腔积液中Crk样蛋白(CRKL)、癌胚抗原(CEA)对恶性胸腔积液的诊断价值。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测47例恶性胸腔积液和46例良性胸腔积液患者的血清和胸腔积液CRKL、CEA水平。结果恶性胸腔积液组血清CRKL显著高于良性胸腔积液组(P<0.001),恶性胸腔积液组胸腔积液CRKL浓度显著高于良性胸腔积液组(P<0.001);恶性胸腔积液组血清CEA显著高于良性胸腔积液组(P<0.001),恶性胸腔积液组胸腔积液CEA浓度显著高于良性胸腔积液组(P<0.001)。ROC曲线分析得血清及胸腔积液CRKL临界值分别为2.04ng/mL、3.04ng/mL,其敏感度分别为80.9%、74.5%;特异性分别为80.4%、84.8%。联合检测血清及胸腔积液CRKL的灵敏度为80.9%,特异性为80.4%;联合检测胸腔积液CRKL及CEA的灵敏度为89.4%,特异性为95.7%;联合检测四者的灵敏度为87.2%,特异性为97.8%。结论血清和胸腔积液中CRKL可作为鉴定良恶性疾病的重要辅助指标;胸腔积液CRKL联合胸腔积液CEA检测可提高恶性胸腔积液的诊断价值。

拟南芥类受体蛋白激酶基因CRK45对外源钙离子的响应

以拟南芥野生型和类受体蛋白激酶基因CRK45的T-DNA插入突变体crk45为材料,采用差异基因表达筛选技术检测ABA处理后野生型和crk45中基因表达的差异。结果显示:(1)crk45突变体中有1个基因的表达比野生型高约4倍。(2)NCBI数据库检索表明,该基因编码的蛋白具有EF手型结构,蛋白序列全长为130个氨基酸,是典型的Ca2+结合蛋白,故命名为CRK45抑制的钙离子结合蛋白(CICBP)。(3)Northern blotting分析结果显示,ABA处理后crk45突变体中CICBP的表达明显升高,证明CICBP基因的确受ABA诱导,且其表达受CRK45的抑制。(4)外源75mmol/L的Ca2+处理后,crk45突变体的萌发率(30.8%)显著高于野生型(17.16%),说明在Ca2+介导下CRK45的功能是抑制种子萌发。(5)qRT-PCR检测显示,野生型中CRK45的表达受Ca2+诱导明显升高,而crk45突变体中的表达一直保持很低,说明crk45突变体是一个基因敲除突变体;Ca2+处理后crk45突变体中CICBP基因表达上调,而野生型中CICBP的表达反而降低,说明Ca2+处理下CRK45抑制CICBP基因的表达。研究表明,ABA或Ca2+处理后,CRK45通过负调控CICBP基因的表达,从而抑制拟南芥种子萌发。