Stathmin和CrkL蛋白在耐阿霉素的K562白血病细胞中表达上调

本研究应用蛋白质组学方法比较白血病K562细胞及其耐阿霉素的K562/A02细胞中蛋白质表达谱的差异,筛选新的耐药相关蛋白。利用荧光差异双向电泳(2D-DIGE)技术分离K562细胞及K562/A02细胞的总蛋白,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)对差异表达蛋白质点进行鉴定,搜索蛋白质数据库,获得差异蛋白质的信息,并用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR法在蛋白质水平和mRNA水平对差异蛋白质进行验证。结果显示,经过DIGE技术和质谱分析,鉴定出8个蛋白质在耐阿霉素的K562细胞中表达有差异,其中2个表达下调,6个表达上调,它们分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞信号转导和基因转录等。在表达上调的蛋白中挑选Stathmin和CrkL蛋白,在K562及其耐药细胞株中进行了蛋白免疫印迹实验,结果与双向电泳结果一致;实时荧光定量PCR显示,CrkL在mRNA水平变化与在蛋白质水平变化一致,而Stathmin在mRNA水平变化与蛋白质水平变化不完全一致。结论:白血病K562细胞及其耐阿霉素K562/A02细胞蛋白质表达谱有差异,Stathmin和CrkL蛋白可能与耐药有关,值得进一步探讨。

过表达CrkL对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和生存力的影响及其机制

目的探讨过表达接合物蛋白CrkL对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞凋亡和生存力的影响及其可能机制。方法将H9C2心肌细胞分为空白组、空质粒组、CrkL过表达组、空白+H/R组、空质粒+H/R组、CrkL过表达+H/R组。空质粒组瞬时转染pCXN2-Flag质粒(空质粒),CrkL过表达组瞬时转染pCXN2-Flag-hCrkL(过表达人CrkL mRNA)质粒,空质粒+H/R组和CrkL过表达+H/R组分别瞬时转染pCXN2-Flag质粒(空质粒)、pCXN2-Flag-hCrkL(过表达人CrkL mRNA)质粒后与空白+H/R组一起进行H/R干预。细胞经分组处理后继续培养48h,采用RT-PCR法检测心肌细胞CrkL mRNA表达,Western blotting检测心肌细胞CrkL蛋白和p-ERK1/2蛋白表达,MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果与空白组、空质粒组比较,CrkL过表达组人CrkL mRNA、CrkL蛋白、p-ERK1蛋白、p-ERK2蛋白表达水平及细胞增殖率均明显增加(P<0.05,P<0.01),凋亡率均明显降低(P<0.05);与空白+H/R组和空质粒+H/R组比较,CrkL过表达+H/R组人CrkL mRNA、CrkL蛋白、p-ERK1蛋白、p-ERK2蛋白表达水平及细胞增殖率均明显增加(P<0.05,P<0.01),凋亡率均明显降低(P<0.01)。结论过表达CrkL可抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,增加细胞存活率,该过程可能是通过p-ERK1/2蛋白介导的。

接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的探讨接合物蛋白Crk和CrkL在上皮性卵巢癌中的表达及意义。方法采用免疫组化SP法,观察Crk和CrkL蛋白在上皮性卵巢癌不同临床病理指标内的表达,并与卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织进行比较。结果上皮性卵巢癌中Crk和CrkL蛋白的表达与卵巢良性上皮性肿瘤及正常卵巢组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、临床分期的上皮性卵巢癌Crk蛋白的表达间差异有统计学意义(P<0.05)。不同分化程度、临床分期的上皮性卵巢癌CrkL蛋白的表达情况间差异无统计学意义(P>0.05)。不同组织病理类型的上皮性卵巢癌Crk和CrkL蛋白的表达间差异无统计学意义(P>0.05)。结论Crk和CrkL蛋白可能在上皮性卵巢癌的发生、发展中发挥某种作用,与CrkL蛋白相比,Crk蛋白的过度表达可能更直接影响着卵巢癌浸润、转移等恶性生物学行为。

接合物蛋白Crk与CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用

目的探讨接合物蛋白Crk和CrkL在卵巢癌细胞株MCAS细胞增殖中的不同作用。方法采用免疫共沉淀法检测上皮性卵巢癌细胞株MACS中Crk和CrkL蛋白与已知的与肿瘤增殖相关的上下游结合蛋白的内源性结合;用可调节性siRNA敲低MACS细胞中内源性的Crk及CrkL,观察二者对细胞生长及存活能力的影响。结果免疫共沉淀显示卵巢癌细胞株MACS中,Crk与影响细胞生长增殖的上游蛋白p130Cas及下游蛋白Sos的结合明显强于CrkL,尽管Crk与CrkL表现出部分相同的免疫原性。免疫印迹显示在加入Dox后即Crk或CrkL表达沉默被启动。Crki/CrkLi细胞中加入Dox后Crk与CrkL表达明显降低[Dox+:Crk(0.021±0.001),CrkL(0.676±0.005);Dox-:Crk(0.544±0.003),CrkL(1.282±0.007),P<0.05]。对可调节性siRNA构建之可控性Crki/CrkLi细胞的连续动态观察发现,Crki细胞表现出细胞增殖力受限仍保存生存活力,而CrkLi细胞则表现出逐渐脱壁至死亡。结论 Crk及CrkL在卵巢癌细胞MCAS的恶性增殖中扮演着不同的作用,Crk蛋白的过度表达可能直接影响着卵巢癌细胞恶性增殖,而CrkL则可能更多地参与了细胞基本生存相关的生物行为。

Hsa_circ_0000392靶向miR-145-5p/CRKL轴调控细胞外调节蛋白激酶通路影响宫颈癌的辐射敏感性

目的探讨hsa_circ_0000392(circ_0000392)对宫颈癌细胞放疗敏感性的影响及其潜在作用机制。方法收集2016—2019年于河南大学淮河医院首次经病理诊断明确的42例宫颈癌患者的宫颈癌组织和癌旁正常组织,根据患者对放射治疗的反应,将癌组织分为放疗敏感和放疗耐受。采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测宫颈癌放疗敏感和放疗耐受肿瘤组织及宫颈癌Hela、SiHa细胞中circ_0000392、miR-145-5p、CT10激酶调节子样蛋白(CRKL)的表达。将siRNA circ_0000392、miR-145-5p mimic、miR-145-5p inhibitor、pcDNA 3.1-CRKL及其阴性对照分别转染至Hela和SiHa细胞,细胞经辐射诱导后,采用克隆形成实验检测细胞存活能力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot检测Bax和Bcl-2、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)1/2和细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2的表达。双荧光素酶报告基因实验验证circ_0000392、miR-145-5p和CRKL之间的靶向关系。裸鼠成瘤实验观察circ_0000392对宫颈癌体内放疗敏感性的影响。结果circ_0000392和CRKL在宫颈癌放疗耐受组织和癌细胞中均呈高表达,miR-145-5p在宫颈癌放疗耐受组织和癌细胞中呈低表达(均P<0.05)。si-circ_0000392#1+6 Gy组Hela和SiHa细胞的克隆形成数分别为(78.67±10.97)个和(71.00±9.54)个,均低于si-Ctrl+6 Gy组[分别为(176.00±22.27)个和(158.33±17.56)个,均P<0.05],细胞凋亡率分别为(41.55±3.40)%和(31.41±3.29)%,均高于si-Ctrl+6 Gy组[分别为(15.91±1.37)%和(13.70±1.89)%,均P<0.05],si-circ_0000392#1+6 Gy组细胞中Bax蛋白表达水平高于si-Ctrl+6 Gy组,Bcl2蛋白表达水平低于si-Ctrl+6 Gy组(均P<0.05)。si-circ_0000392#1+miR-145-5p inhibitor+6 Gy组Hela和SiHa细胞的克隆形成数分别为(171.33±25.01)个和(137.00±21.66)个,均高于si-circ_0000392#1+inhibitor NC+6 Gy组[分别为(84.67±17.79)个和(71.00±11.00)个,均P<0.05],细胞凋亡率分别为(17.41±2.58)%和(15.96±1.25)%,均低于si-circ_0000392#1+inhibitor NC+6 Gy组[分别为(40.29±2.92)%和(30.82±2.34)%,均P<0.05],si-circ_0000392#1+miR-145-5p inhibitor+6 Gy组细胞中Bax蛋白表达水平低于si-circ_0000392#1+inhibitor NC+6 Gy组,Bcl2蛋白表达水平高于si-circ_0000392#1+inhibitor NC+6 Gy组(均P<0.05)。circ_0000392能够与miR-145-5p靶向结合,而CRKL是miR-145-5p的下游靶基因。miR-145-5p mimic+6 Gy组Hela和SiHa细胞的克隆形成数分别为(74.33±10.02)个和(66.00±12.17)个,均低于mimic NC+6 Gy组[分别为(197.67±17.21)个和(157.67±11.59)个,均P<0.05],细胞凋亡率分别为(45.58±2.16)%和(32.10±3.55)%,均高于mimic NC+6 Gy组[分别为(15.85±2.45)%和(13.99±1.69)%,均P<0.05],miR-145-5p mimic+6 Gy组细胞中Bax蛋白表达水平高于mimic NC+6 Gy组,Bcl2蛋白表达水平低于mimic NC+6 Gy组(均P<0.05)。miR-145-5p mimic+pcDNA-CRKL+6 Gy组Hela和SiHa细胞的克隆形成数分别为(158.00±15.88)个和(122.33±13.65)个,均高于miR-145-5p mimic+pcDNA组+6 Gy组[分别为(71.33±8.02)个和(65.67±12.22)个,均P<0.05],细胞凋亡率分别为(19.50±3.45)%和(17.04±0.94)%,均低于miR-145-5p mimic+pcDNA组+6 Gy组[分别为(44.33±2.36)%和(32.05±2.76)%,均P<0.05],miR-145-5p mimic+pcDNA-CRKL+6 Gy组细胞中Bax蛋白表达水平低于miR-145-5p mimic+pcDNA组+6 Gy组,Bcl2蛋白表达水平高于miR-145-5p mimic+pcDNA组+6 Gy组(均P<0.05)。sh-circ_0000392组小鼠肿瘤体积较小,肿瘤重量降低(均P<0.05)。小鼠移植瘤组织中circ_0000392、miR-145-5p、CRKL mRNA相对表达水平降低减少,CRKL、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白相对表达水平降低,Bax蛋白相对表达水平升高(均P<0.05)。结论circ_0000392可增强宫颈癌细胞的放疗敏感性,其作用机制可能与靶向miR-145-5p调控CRKL/ERK信号通路有关。