茶藨生柱锈菌(Cronartiumribicola)研究进展

由茶藨生柱锈菌引起的红松疱锈病和华山松疱锈病,严重危害着红松、华山松等树种,为此,对茶藨生柱锈菌的分类地位、转主寄主以及遗传关系、防治措施等方面进行介绍,以期为有效防治该病菌提供理论依据,同时,为进一步深入研究该病菌指明方向。

3株木霉(Trichoderma spp.)对华山松疱锈病菌锈孢子的破坏作用

从不同来源的茶藨生柱锈锈孢子堆和疱锈病枝干上分离获得3株木霉,室内生测结果表明,3株木霉的菌丝和培养滤液对锈孢子壁有较强的破坏作用;菌株TR2和TR3在锈孢子堆上生长速度快,锈孢子死亡率随孢子壁破坏率的增加而升高,锈孢子壁对孢壁降解酶有强烈诱导作用;TR1对锈孢子壁的破坏作用弱于TR2和TR3,但在PD培养液中有较强的产毒能力,锈孢子壁能抑制TR1菌株产毒。

茶麃生柱锈菌重寄生拟盘多毛孢产毒培养条件的筛选

从茶麃生柱锈菌的锈孢子堆上分离纯化了3株重寄生拟盘多毛孢,编号cr012、cr013和cr014。它们形态各异,但对茶麃生柱锈菌和石楠锈孢锈菌的锈孢子均有强寄生作用,且对10种常见植物病原真菌具有广谱抗性。通过台盼蓝染色法筛选出了3株重寄生菌破坏茶麃生柱锈菌锈孢子的最佳产毒培养条件,为毒素的分离及生物农药的开发提供依据。

茶藨生柱锈重寄生木霉产毒条件的优化

运用产毒培养基筛选、锈孢子诱导和正交试验对茶藨生柱锈重寄生木霉SS003菌株(Trichoderma at-roviride)的产毒营养条件进行优化。结果表明,SS003在5种产毒培养基中均能产毒和生长,但Richard培养基更适合产毒培养,PD培养基则更适合菌丝生长;茶藨生柱锈的锈孢子对产毒具有一定抑制作用;SS003菌株的最佳产毒营养组合为:蔗糖50.00 g/L、KNO310.00 g/L、KH2PO45.00 g/L、MgSO43.00 g/L和FeCl30.02 g/L,培养液中各个营养元素的减量不利于毒素的产生。

3株茶藨生柱锈重寄生木霉菌的形态鉴定及ITS序列分析

[目的]探讨更为客观的木霉菌鉴定手段。[方法]在形态分类的基础上结合分子鉴定手段(rDNA-ITS序列分析),对3株茶藨生柱锈重寄生木霉菌进行分类鉴定。[结果]依据TR1的培养性状和显微特征描述,初步鉴定该菌株为深绿木霉(T.atroviride);TR2、TR3的培养性状和显微特征在一定程度上相似,依据其形态特征,初步鉴定这2个菌株为绿色木霉(T.viridePers.ex Fr.)。从Genbank中深绿木霉和绿色木霉的6个菌株与TR1、TR2T、R3所作的系统发育树可知,TR1应该归为深绿木霉,TR2和TR3属同种真菌,应该归为绿色木霉,这与形态学观察结果一致。[结论]形态特征结合ITS序列分析可作为木霉菌分类鉴定的依据。

西南地区茶生柱锈重寄生菌的分离与鉴定

华山松疱锈病是华山松Pinus armandi最严重的病害之一。为了利用重寄生菌对华山松疱锈病进行生物防治,对其病原菌茶生柱锈Cronartium ribicola的重寄生菌进行了分离和鉴定。依据柯赫氏三原则对分离得到的真菌进行鉴定,得到茶生柱锈的重寄生菌链格孢Alternariaspp.,镰刀菌Fusariumspp.,棒束孢Isariasp.,拟盘多毛孢Pestalotiopsissp.,木霉Trichodermaspp.及粉红单端孢Trichothecium roseum。经显微和超显微观察发现接种重寄生菌后锈孢子受到不同程度的破坏,且不同的重寄生菌对锈孢子有不同的作用方式。

2株茶藨生柱锈重寄生木霉胞壁降解酶的基本性质研究

为了给β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶的分离纯化及重寄生菌的利用提供理论依据,从茶藨生柱锈（Cronartium ribicola J.C.Fischer）的重寄生菌TR1和TR2中提取了β-1,3葡聚糖酶和几丁质酶,并进行了粗酶活性测定。结果显示,2菌株所产β-1,3-葡聚糖酶最适温度均为35℃,TR1所产β-1,3葡聚糖酶的最适pH4.0,Km值为43.82μg/mL,Ca^2＋是其激活剂,Cu^2＋、Fe^3＋、Al^3＋、Zn^2＋为其抑制剂。TR2所产β-1,3葡聚糖酶的最适pH5.0,Km为71.28μg/mL,Ca^2＋和Mn^2＋是其激活剂,Cu^2＋、Fe^3＋、Al^3＋为其抑制剂。2菌株所产几丁质酶的激活剂为Mn2＋和Ca2＋,抑制剂为Cu^2＋。TR1所产几丁质酶的最适温度为40℃,最适pH6.0,Km为92.49μg/mL;TR2所产几丁质酶的最适温度范围较宽为30~50℃,最适pH5.0,Km为71.11μg/mL。TR1和TR2所产β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶稳定性较高,直接利用粗酶在野外防治疱锈病具有一定的可行性。

2株重寄生木霉菌丝生长的生物学特性

对2株茶藨生柱锈菌（Cronartium ribicola J．C．Fischer）重寄生木霉（Trichoderma spp．）TR1、TR2菌株菌丝生长及产孢条件进行单因素筛选及正交实验。结果表明：TR1菌丝生长速度快，且极易产生分生孢子；TR2菌丝生长速度相对较慢，产孢受一定条件限制。光照和VB2能明显刺激TR2分生孢子的产生。2株菌在以大麦粉、黄豆粉、KH2PO4、复合VB为培养基，5％接种量、120r／min、pH为6的条件下菌丝生长最佳。TR1和TR2菌丝生长的最适温度范围及水势分别为25～30℃、-2．32MPa和20～25℃、-4．54MPa。

4种木霉对松疱锈病菌细胞壁的破坏作用

为了解木霉属真菌分泌胞壁降解酶的能力及筛选获得降解植物锈病菌的优良生防菌株,对4个种48株木霉进行接种保湿培养和定期观察。结果表明:4种木霉中的长枝木霉所有菌株在茶藨生柱锈的锈孢子堆上生长都较弱,且对锈孢子壁没有破坏作用,而其他3个种的部分菌株能在锈孢子堆上生长且对锈孢子壁造成不同程度的破坏,但不同种及同种不同菌株的生长速度和对锈孢子的破坏能力差异较大;3种木霉中,深绿木霉的多数菌株在锈孢子堆上的生长良好,对锈孢子壁的破坏作用最强,康宁木霉和哈茨木霉的部分菌株次之;采用DNS显色法检测锈孢子壁诱导3株木霉分泌的胞壁降解酶(几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶)活性,结果显示其诱导酶活的强度与菌株破坏接种锈孢子壁的程度基本一致。

茶藨生柱锈重寄生木霉分生孢子萌发的生物学特性

3株茶藨生柱锈菌（Cronartium ribicola J.C.Fischer）重寄生木霉（Trichoderma spp.）（TR1、TR2、TR3）的分生孢子在水琼脂、葡萄糖、PDA、改良Fries、华山松树皮浸汁和锈孢子培养基上均能萌发,TR1在各种培养基上的萌发率最高,萌发速度最快,而TR2和TR3在水琼脂和葡萄糖培养基上的萌发则较差;3个菌株孢子萌发的最适温度范围为20-30℃,其中TR1的萌发温度范围最广,在15-35℃内均能较好地萌发;3种孢子萌发的最适pH范围为4-5,相对湿度范围35%-100%（50%以上较易萌发）;黑暗和交替黑暗能刺激TR1孢子萌发,连续光照则有利于TR2和TR3孢子的萌发。

五针松疱锈病病原菌生活史的计算机模拟

利用计算机动画技术对红松疱锈病（ＰｉｍｕｓＫｏｒａｉｅｎｓｉｓｂｌｉｓｔｅｒｒｕｓｔ）病原菌茶生柱锈病（Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍｒｉｂｉｃｏｌａ）生活史进行了计算机模拟，概述了模拟的内容、方法、过程、特点等，并展望了这一技术的应用前景。

茶藨生柱锈菌致病性分化的初步研究

采用交互接种的方法对华山松疱锈病、红松疱锈病的病原菌茶藨生柱锈菌的致病性分化进行了研究。结果表明:(1)红松疱锈病的病原菌锈孢子只能侵染其本地的转主寄主植物东北茶藨子;(2)华山松疱锈病的病原菌锈孢子能转主侵染多种不同地区的茶藨子植物;(3)所有华山松疱锈病病原菌的锈孢子均不能转主侵染东北茶藨子;(4)初步认定马先蒿属植物不是华山松疱锈病病原菌的转主寄主。

营养条件对茶藨生柱锈重寄生菌生长的影响

采用固体培养和液体发酵相结合的方法,探索了培养真菌常用的7种碳源,10种氮源、7种无机盐和5种维生素对茶藨生柱锈重寄生菌拟盘多毛孢之一种(Pestalotiopsissp.)MM011菌株菌丝生长的影响。结果表明,多糖(可溶性淀粉、玉米粉)是该重寄生菌菌丝生长的最佳碳源;最佳氮源为有机氮中的黄豆粉、酵母浸膏和蛋白胨;最适无机盐为磷酸二氢钾和磷酸二氢钠;不同维生素对菌丝生长有一定影响,但作用不明显。

茶藨生柱锈菌锈孢子生物学特性研究

用6个不同地点的五针松疱锈病病原菌锈孢子作温度、相对湿度、酸碱度、营养条件及光照条件5个因素下的孢子萌发实验,结果表明：锈孢子的萌发率普遍低,一般不超过10%;在0～35℃均可以萌发,最适的温度是20～30℃,但不同来源地的孢子最适温度有一定的差别;相对湿度10%以上锈孢子都可以萌发,以50%～75%的萌发率最高;锈孢子萌发适应的pH值范围较广,以pH值6～9较适宜,但以中性的酸碱度最佳;光暗交替对孢子萌发有利,营养条件对萌发的影响不明显,各种浸汁对萌发率影响不大.经方差分析,在最适的温湿度和酸碱度条件下,各地的锈孢子萌发率差异显著;在不同的营养条件和光照条件下,锈孢子萌发率差异不明显.

茶藨生柱锈菌侵染后华山松树皮矿质元素的变化

[目的]比较华山松健康树皮、感疱锈病树皮中矿质元素含量的差异,为深入了解该病害对华山松的影响机理、探索水肥控制该病害的新途径提供理论依据。[方法]采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定华山松感染疱锈病(Cronartiu mribicola)后树皮矿质元素含量的变化。[结果]从华山松健康树皮中检测出矿质元素45种,从感染疱锈病树皮中检测出矿质元素46种。这些矿质元素中植物生长必需矿质元素均为14种,其他矿质元素31种(感病后为32种)。华山松感病后矿质元素总量降低了15.77%,其中,植物生长必需元素降低了15.54%,其他元素含量降低了17.07%,其中Ca含量减少最多,减幅约达75%。含量大小顺序也发生了变化,健康树皮中为Na>Ca>B>K>Si>Mg>S>P,而在感病树皮中为Na>B>K>Ca>Mg>P>Si>S。[结论]该研究结果为施用矿质元素控制疱锈病病害奠定了基础。

茶藨生柱锈重寄生木霉粗毒素的基本性质

采用液体发酵和生物测定相结合的方法,研究了茶藨生柱锈(Cronartium ribicola)重寄生木霉SS003菌株(Trichoderma atroviride)所产粗毒素的基本性质。结果表明,SS003所产粗毒素为一类非蛋白质、极性较大的物质,具有较高的热稳定性和酸碱稳定性,能被甲醇较好地提取出来,可被活性碳有效地吸附并为甲醇所洗脱。该结果为SS003菌株的活性成分研究及进一步开发利用奠定基础。

华山松疱锈病检疫技术研究初探——组织染色法

以病区华山松罹病植株和非病区华山松正常植株为材料,通过组织切片后从两种不同染色方法中选出品红染色法,再经正交试验对品红染色法进行综合检测,筛选最佳染色方案.按此方法检测出华山松疱锈病病原菌在罹病植株枝干部的分布情况,为基层的检疫及防治工作提供理论依据.

茶藨生柱锈重寄生菌粗毒素的基本性质

对茶藨生柱锈重寄生菌拟盘多毛孢之一种产生的粗毒素进行基本性质研究.结果表明:该重寄生菌所产毒素是一类小分子、极性较大的非蛋白类物质,具有热稳定性和酸碱稳定性,能被甲醇从培养液中较好地提取出来.

华山松对疱锈菌感性遗传分析的ISSR-PCR反应体系建立及引物筛选

用采自云南华山松疱锈病3个典型发病点的华山松植株样品,组成健康株组和感病株组进行ISSR-PCR反应体系的建立和引物筛选.构建的华山松ISSR-PCR最优反应体系为:反应总体积25μL,其中含10×Buffer2.5μL,Taq DNApolymerase 0.3μL(终浓度1.5 U),Primer2.0μL(终浓度2.0μmol/L),DNA Template 5.0μL(终浓度1.5 ng/μL),Mg2+2.5μL(终浓度2.5 mmol/L),dNTP2.5μL(终浓度250μmol/L),ddH2O10.2μL.扩增反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,47℃左右退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环,最后在72℃F继续延伸10 min.通过初筛和中试筛选出扩增反应清晰、扩增稳定的10个引物作扩大实验,在健康株组和感病株组的两个DNA pool之间有明显的PCR扩增条带多态性.筛选出的ISSR引物可提供研究华山松种群差异的遗传标记.

茶蔗生柱锈菌选择性寄生茶蔗子植物的遗传分析

为探讨转主寄主茶藨子植物的遗传背景与被茶藨生柱锈菌选择性寄生之间的关系。分析了7个五针松疱锈病典型发病区来源的11种茶蔗子植物之间的ITS遗传关系,并结合不同来源的寄主与病原之间交互接种实验的结果,比较不同发病区的茶蔗生柱锈菌孢子对不同转主寄主的感染亲和特性。结果显示:易被多个发病区的茶蔗生柱锈菌孢子所感染的茶藨子植物的ITS遗传关系很接近;荼蔗生柱锈菌特异性地选择生活地的茶蔗子植物作为寄主;地域分布广泛的茶藨子植物容易被多个发病区的茶蔗生柱锈菌选择作为转主寄主。本研究揭示出在茶蔗生柱锈菌特异地选择其转主寄主时,对寄主茶蔗子植物的遗传结构和地域分布范围有特异的倾向性。