三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Ⅰ型Crustin抗菌肽的基因克隆与真核重组表达

Crustin是目前报道广泛存在于甲壳类中的一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽,主要由甲壳类血淋巴细胞合成。本研究采用RACE技术和真核表达技术,进行了三疣梭子蟹Crustin基因的克隆和重组表达研究。结果表明,在三疣梭子蟹血细胞Crustin基因cDNA全序列中,开放阅读框编码110个氨基酸残基的Crustin前体,Crustin前体由N端21个氨基酸残基的信号肽、富含Cys结构域和C端WAP结构域三部分组成,属于I型Crustin,构建的分泌型真核表达质粒pVT102U/α-crustin转化酿酒酵母S78,经RT-PCR和SDS-PAGE电泳验证,表明重组Crustin表达成功。

凡纳对虾crustin 2基因的序列及结构分析

以凡纳对虾(Litopenaeus vannamei)crustin 2基因为研究对象,通过基因克隆、氨基酸序列比对、系统进化树分析以及分子结构的初步预测。结果表明,crustin 2基因可能在凡纳对虾的先天免疫系统中发挥着重要的抗菌功能,是一个重要的免疫效应基因。

拟穴青蟹抗菌肽Crustin新变体的表达特性与抗菌功能

Crustins是一类较早发现并广泛分布在甲壳动物中且富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,能够参与抗菌免疫应答.从拟穴青蟹( Scylla paramamosain )中克隆获得一个 Crustin 基因新变体,命名为 SpCrus1a ,其cDNA序列全长744 bp,开放阅读框编码113个氨基酸,成熟肽分子质量10.03 ku,理论等电点8.30.表达分析结果发现其转录本主要存在于鳃、卵巢、上皮组织中,经脂多糖刺激后 SpCrus1a 表达会上调.体外合成 Sp Crus1a 的第29~47位氨基酸( Sp Crus1a 29-47 )进行抗菌活性实验,发现其对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性,而对被测的革兰氏阴性菌抗菌活性较弱或无抗菌活性.浓度24 μmol/L的合成肽 Sp Crus1a 29-47 能够在5 min内杀死大多数的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),在120 min内杀死全部的金黄色葡萄球菌.扫描电镜分析发现合成肽 Sp Crus1a 29-47 可造成金黄色葡萄球菌表面结构崎岖不平,高浓度 Sp Crus1a 29-47 会引起细菌大量死亡.上述结果表明 Sp Crus1a是抗菌肽Crustin的新变体.

拟穴青蟹两个Crustin新变体的克隆与表达分析

Crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个Crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均含有12个位置高度保守的半胱氨酸.SpCrus1b在信号肽和乳清酸蛋白(WAP)结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,属于典型的Ⅰ型Crustins;SpCrus2b除具有SpCrus1b的结构特征外,在近N-端额外含有一个甘氨酸富集区,属于典型的Ⅱ型Crustins.基因组结构分析显示SpCrus1b的基因组DNA序列为4个外显子/3个内含子结构,而SpCrus2b的基因组DNA序列为2个外显子/1个内含子结构.两者均主要在鳃中表达,且在脂多糖(LPS)刺激24h和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激12h后表达量均极显著上调(p<0.01),表明SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹抗细菌和抗病毒的先天免疫过程.

克氏原螯虾抗菌肽crustin5基因克隆及其表达分析

【目的】深入了解克氏原螯虾先天免疫过程中抗菌肽的作用与功能,丰富先天免疫中抗菌肽的理论知识,为克氏原螯虾的病害机理研究及防控措施制定提供参考依据。【方法】从克氏原螯虾肝胰腺组织提取总RNA,利用PCR扩增crustin5基因全长cDNA序列,运用DNAMAN 6.0、ProtParam、ProtScale、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件对其进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测crustin5基因在克氏原螯虾各组织中的表达情况。【结果】克氏原螯虾crustin5基因cDNA序列全长954 bp,开放阅读框(ORF)为429 bp,共编码167个氨基酸残基,其编码蛋白相对分子量为16485.42 Da,理论等电点为8.58,为不稳定的疏水性蛋白。克氏原螯虾crustin5蛋白具有典型的crustins家族结构特征,包括N端的信号肽,C端的WAP结构域,以及二者间的半胱氨酸富集区;其二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链分别占20.36%、7.78%、58.08%和13.77%。crustin5基因在克氏原螯虾血细胞、肝胰腺、鳃、肠道、肌肉和淋巴器官等6种组织中均有不同程度的表达,以在血细胞中的相对表达量最高,淋巴器官次之,在肌肉组织中的相对表达量最少。【结论】克氏原螯虾抗菌肽crustin5具有典型的crustins家族结构特征,且主要分布在血细胞和淋巴器官中,说明crustin5是在克氏原螯虾的血淋巴中参与先天免疫并发挥抗菌作用。

中华绒螯蟹甲壳肽EsCrus3和EsCrus4表达模式与免疫功能

研究从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中克隆并鉴定了两个Ⅰ型甲壳肽(Crustin)基因,分别命名为EsCrus3和EsCrus4。随后通过生物信息学、基因表达分析、蛋白表达与纯化、免疫功能验证等研究手段,分析了这2个新型抗菌肽的表达、结构和功能。EsCrus3的cDNA序列全长567 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为351 bp,编码116个氨基酸(Amino acid,aa);EsCrus4序列全长743 bp,ORF区288 bp,编码95个aa。两者都含有信号肽、富半胱氨酸的结构域(Cysteine-rich region,CRR)和WAP(Whey acidic protein)结构域。EsCrus3和EsCrus4氨基酸序列的一致性仅为30.77%,并且进化分析显示EsCrus3和EsCrus4分别位于两个具有分类意义的分支上,提示两者生物学功能可能存在差异。EsCrus3和EsCrus4均在卵巢中高度表达且具有相似的表达水平,在金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激时呈上调表达趋势,其中EsCrus3响应速度更快,在刺激2h时上调表达,EsCrus4则在刺激后12—24h时显著上调。重组蛋白EsCrus3和EsCrus4对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均具有不同程度的结合活性,并且对不同微生物多糖结合活性也存在明显差异。EsCrus3对革兰氏阳性菌的肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LTA)具有很高结合活性,对革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)和真菌β-葡聚糖也有一定结合活性,而EsCrus4只对PGN具有显著结合活性。上述研究结果表明EsCrus3响应病原刺激更迅速、与病原多糖结合能力更强,提示其在卵巢的免疫防御体系中发挥更重要作用。此外,EsCrus3和EsCrus4序列和功能的差异为新型药物的挖掘提供了基础数据。

斑节对虾carcininPm3的表达及其无标签多肽的获得

crustin是对虾中重要的抗菌肽,本研究获得的carcinin Pm3属于斑节对虾crustin家族,是一种新型抗菌肽,成熟肽含有92个氨基酸,与其他对虾抗菌肽的同源性小于45%.根据其氨基酸序列和大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的密码子偏好性设计carcinin Pm3的基因序列,将carcinin Pm3连接到原核表达载体pSmartI-SUMO上,构建重组表达载体p SmartI-SUMO-carcinin Pm3,再转化至原核表达菌株E.coli BL21(DE3)中,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导SUMOcarcinin Pm3的融合表达,进一步优化其表达条件,获得表达量大、可溶性高的重组蛋白.通过亲和层析纯化得到重组蛋白,蛋白的质量浓度达到195μg/m L.利用SUMO酶去除SUMO融合标签,获得没有外源标签的carcinin Pm3抗菌肽,可用于蛋白功能分析、抗体制备等研究.研究结果为carcinin Pm3功能的分析及应用提供参考.

脊尾白虾抗菌肽Crustin基因的克隆、表达与功能研究

为研究脊尾白虾(Exopalaemoncarinicauda)抗菌肽Crustin的结构特征和功能,本研究从脊尾白虾中克隆得到一个Crustin的新变体,命名为EcCrustin1。研究结果表明,EcCrustin1基因cDNA序列长度为740 bp,开放阅读框(ORF)长度为477 bp,编码158个氨基酸,EcCrustin1蛋白具有Ⅱ型Crustin的典型特征,包括N端的信号肽,C端WAP结构域,以及二者之间的甘氨酸富集区(GRR)和半胱氨酸富集区(CRR)。EcCrustin1基因主要在脊尾白虾血淋巴中表达,副溶血弧菌刺激后,EcCrustin1在血淋巴中的表达显著上调(P<0.05),说明EcCrustin1在脊尾白虾先天免疫应答中发挥重要作用。此外,通过原核表达获得了该抗菌肽的重组蛋白,为进一步研究其抑菌功能和机理提供了基础。

墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)CrustinⅡ型基因的克隆与原核重组表达

Crustin是一类具有广谱抗菌活性的且富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,广泛分布于甲壳动物中。为研究CrustinⅡ基因在墨吉明对虾中的免疫功能,本研究采用了RT-PCR技术获得了墨吉明对虾CrustinⅡ基因的ORF序列,共390 bp,编码一个129个氨基酸残基的多肽,且具有典型的Ⅱ型Crustin基因结构：N-末端的信号肽、C-末端的WAP（whey acidic protein）结构域、Gly和Cys富集区;运用实时荧光定量PCR技术检测了CrustinⅡ基因在墨吉明对虾不同组织中的表达模式,数据分析表明,CrustinⅡ在血细胞中高量表达,而在肠道、鳃、肝胰腺、尾部肌肉、胃、眼柄和心脏组织中的表达量非常低,且具有显著性差异;同时本研究运用原核重组表达技术成功诱导出CrustinⅡ蛋白。本研究为进一步探究Crustin在对虾的先天性免疫功能和防御机制提供理论依据。