Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。

连续饲喂转Cry1Ab/1Ac基因糙米对2个世代鹌鹑生长发育的影响

本试验旨在研究连续饲喂转Cry1 Ab/1 Ac基因糙米对2个世代鹌鹑生长发育的影响。选取健康的1日龄日本鹌鹑（Coturnix japonica）402羽随机分成2组,每组3个重复,每个重复67羽,雌雄混养。2组分别为转基因组和非转基因组,分别饲喂含转Cry1 Ab/1 Ac基因或非转基因糙米的饲粮,35日龄时从各组中分别挑选健康的体重相近的鹌鹑72羽,平均分成6个重复,每个重复3羽雄性9羽雌性,分别继续饲喂2种饲粮,饲养至91日龄。2个组85-91日龄所产的蛋分别孵化,孵化出的子代鹌鹑分别继续饲喂2种饲粮,分组及饲养管理与亲代相同。结果表明：转基因糙米中的粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维等营养成分的含量与非转基因糙米没有显著差异（P〉0.05）;与非转基因组相比,转基因组亲代和子代鹌鹑的平均日采食量、平均日增重和料重比均无显著差异（P〉0.05）;2代鹌鹑的肝脏、心脏、睾丸和卵巢等器官指数也与非转基因组无显著差异（P〉0.05）。结果表明,连续2个世代采食含转Cry1 Ab/1 Ac基因糙米的饲粮对日本鹌鹑的生长发育没有显著影响。

GPTMS/TiO_(2)复合催化剂对AB1的降解机理分析

染料生产过程中产生的印染废液对环境或人体的危害较大,酸性黑1(AB1)是其中主要的有害物质之一。为了提高印染废液中AB1的处理效率,本研究提出了一种新型复合材料,作为印染废液中AB1的降解催化剂。该催化剂以TPNC与纳米TiO_(2)为主体,以CPTMS为链接剂。结果显示,TiO_(2)作为催化剂时,光照催化90 min后,溶液中的AB1质量分数仍有63.8%,以质量分数0.004%TNPC-GPTMS/TiO_(2)作为催化剂时,光照催化90 min后,溶液中AB1已被完成降解,溶液完成脱色。本研究提出的新型催化材料可以有效提高印染废液中的AB1处理速度。

基于胚胎干细胞模型的Cry1Ab蛋白发育毒性

目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性。方法:设置Cry1Ab蛋白7个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3。通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50%inhibition concentration of growth and viability, IC_(50))。设置Cry1Ab蛋白5个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以5-FU为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies, EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50%inhibition concentration of differentiation, ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction, qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5和β-MHC)的mRNA表达情况。结果:5-FU的IC_(50,3T3)为46.37μg/L,IC_(50,ES)为32.67μg/L,ID_(50,ES)为21.28μg/L,根据判别函数结果将5-FU分类为强胚胎毒性物质。不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P>0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P<0.05),且具有剂量依赖趋势(P<0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P<0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验模型中未观察到31.25~2 000.00μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性。

转BtCry1Ac基因对107杨材性的非预期影响

为了探究外源BtCry1Ac基因对107杨材性性状产生的非预期影响,以转BtCry1Ac基因107杨2个株系(ECA1和ECA2)和野生型株系(WT)为材料,对其木材化学组分、物理和力学性质及纤维形态指标进行了定量测定。结果显示:BtCry1Ac基因的转入使107杨木材材性发生了非预期变化,具体表现为ECA1和ECA2的纤维素、灰分、苯醇抽出物及1%NaOH抽出物组分含量均显著低于WT(P<0.05);ECA1和ECA2的气干干缩性、全干干缩性显著低于WT(P<0.05),且ECA1和ECA2的气干密度、全干密度显著高于WT(P<0.05);ECA1和ECA2的冲击韧性、抗弯强度、抗弯弹性模量和顺纹抗压强度均显著高于WT(P<0.05);ECA1和ECA2的纤维长度显著低于WT(P<0.05)。总体表现为转基因株系的木材有着更小的干缩性,更高的密度和强度,其材性发生了非预期性改变,研究结果为转基因杨树的推广与应用提供了参考。

利用胚胎干细胞骨分化实验评价Cry1Ab蛋白的发育毒性

目的通过小鼠胚胎干细胞骨分化实验研究Cry1Ab蛋白对胚胎干细胞成骨分化过程的影响,以评估Cry1Ab蛋白的发育毒性。方法以Cry1Ab蛋白为受试物,设置5个剂量(125,250,320,1000,2000 ng/ml)染毒小鼠胚胎干细胞形成的拟胚胎体(embryonic body,EB),设置溶剂对照和阳性对照,同时向培养基中添加β-甘油磷酸盐(10 mmol/L)、抗坏血酸(50μg/ml)和维生素D3(500μmol/L)诱导EB向骨细胞分化,通过茜素红S染色和吸光度检测确定骨细胞钙化结节生成情况;收集EB制备细胞裂解液,通过BCA法测量细胞总蛋白浓度,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测试剂盒检测细胞裂解液中ALP活性;收集EB样本提取总RNA,通过qPCR检测骨细胞分化相关标志物Runx2、SPARC和I型胶原的基因表达情况。结果与对照组相比,不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的EB细胞团大小、钙化结节数量无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的细胞总蛋白浓度和ALP活性与对照组相比无统计学差异(P>0.05);Cry1Ab蛋白各浓度组的Runx2、SPARC和I型胶原基因表达水平与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。结论本次试验中,未观察到Cry1Ab蛋白对小鼠胚胎干细胞成骨分化过程产生影响,125~2000 ng/ml的Cry1Ab蛋白不具有发育毒性。

酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺优化

为获得优质的核桃蛋白血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽的制备原料及优化其制备工艺,采用连续提取法从脱脂核桃粕中依次分离出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白-1和谷蛋白-25种组分蛋白,测定5种组分蛋白的占比及ACE抑制率,以ACE抑制率最大的组分蛋白作为原料采用酶解法制备ACE抑制肽,在筛选出最适酶解用酶基础上,采用单因素试验与响应面试验优化酶解制备核桃蛋白ACE抑制肽的工艺。结果表明:5种组分蛋白中谷蛋白-1占比仅次于谷蛋白-2,且其ACE抑制率最高,以核桃谷蛋白-1为原料,在筛选出胃蛋白酶作为酶解用酶基础上,经工艺优化得到最优的酶解法制备核桃谷蛋白-1 ACE抑制肽的工艺条件为酶解温度46℃、酶解时间6 h、酶用量4.2%(以底物质量计)、酶解pH 1.6,在该条件下所得核桃谷蛋白-1酶解液的ACE抑制率为(50.08±2.34)%。因此,核桃谷蛋白-1经胃蛋白酶酶解可生产ACE抑制活性较高的核桃多肽。

转BtCry1Ac基因107杨生长分析

以4个7年生转BtCry1Ac基因107杨无性系及其未转基因对照为材料,对河北深州市、枣强县和盐山县3个地点营建的对比试验林进行调查,对其生长进行分析,探究外源基因的转入对其生长产生的影响。结果表明,转基因株系间平均树高、胸径、材积无显著差异,但均显著低于未转基因对照。转基因株系在不同试验林生长量表现不同,枣强试验林与盐山、深州试验林在生长量方面均存在显著差异,盐山试验林表现最好,枣强试验林平均树高、胸径、材积仅为盐山的86.5%、84.8%、65.1%。多点联合方差分析表明,株系与地点之间互作明显。转基因株系与对照树高、胸径、材积方面,在速生期、年平均最大生长量等时期较为相近,生长模式基本相同。

转cry1 Ab/cry1 Ac基因籼稻对稻田节肢动物群落影响

将稻田节肢动物群落按营养关系划分为 5个功能团 ,即植食类、寄生类、捕食类、腐食类和其它类 ,从功能团优势度、功能团内科组成及其优势度、群落主要参数及群落相异性等方面 ,经两年四点的调查就 2个转cry1Ab cry1Ac基因籼稻(Bt水稻 )品系TT9 3和TT9 4对稻田节肢动物群落的影响作了较系统评价。植食类、寄生类和腐食类功能团内某些优势科的优势度在Bt水稻田与对照 (IR72 )田之间有时呈显著或极显著差异 ,如Bt水稻田中茧蜂或姬蜂科的优势度有时明显低于对照。但是 ,在大多情况下Bt水稻田与对照田之间功能团优势度、功能团内科组成及其优势度、群落主要参数 (物种丰富度、Shannon Wiener多样性指数、均匀性指数、优势集中性指数 )及其时间动态基本无明显差异 ;Bt水稻田与对照田间植食类、寄生类、捕食类亚群落和整个节肢动物群落的相异性大多较低。可见 。

农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素。基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株。经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cry1 Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7%。通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料。

抗虫基因cry1Ab/Ac在水稻杂交转育后代中的表达效应

以转入了Bt基因cry1Ab/Ac的水稻品系TT51为供体,与10个恢复系杂交。通过分子检测,并结合田间的抗虫性观察,筛选出农艺性状良好的转基因纯合株系。抗虫基因在所有的杂交组合后代中按照孟德尔规律遗传,但是不同遗传背景下的表达量有很大差异。Cry1Ab/Ac蛋白含量维持原有水平的株系对螟虫表现出良好的抗性,蛋白含量降低的株系则受到轻微的危害。纯合株系的部分农艺性状发生变异,其程度与Cry1Ab/Ac蛋白含量有关。结果为利用杂交转育培育优良抗虫水稻提供依据。

转Cry1Ac+Cry2Ab抗虫棉对3种害虫的存活、生长发育及中肠相关酶活性的影响

以转Cry1Ac基因棉花和常规非转基因棉花为对照,系统研究了转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花对棉铃虫、斜纹夜蛾、甜菜夜蛾的存活、生长发育及中肠酶活性的影响。研究结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花和转Cry1Ac基因棉花叶片对3种害虫的慢性毒性差异较大,对每种害虫的抗性程度也有一定的差异;饲喂转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花和转Cry1Ac基因棉花叶片的3种害虫幼虫生长发育进度明显缓慢、体重明显减轻,相关酶活性也有不同程度的变化,但每种酶的变化有一定的差异。

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。

泥鳅生长及抗氧化-解毒酶系统对水体中转Cry1Ab/Ac基因水稻残遗物的响应

在泥鳅养殖水体中添加稻秆粉模拟水稻残遗物生境,研究了泥鳅生长和肝胰脏抗氧化酶(SOD、CAT)与解毒酶(GST)活性对转Cry1Ab/Ac基因水稻‘华恢1号’(HH1)的响应。设计以HH1稻秆粉10 mg·L?1、50 mg·L?1、100 mg·L?1和200 mg·L?1 4个梯度浓度处理泥鳅为试验组,以非转Bt基因水稻‘明恢63’(MH63)稻秆粉处理组为阴性对照,不加稻秆粉的基础饲养组为空白对照。结果显示:在4种稻秆粉浓度下,HH1组与MH63对照组泥鳅的特定生长率、肥满度、内脏系数及SOD、CAT和GST酶活性均无显著差异(P>0.05);与空白对照比较,稻秆粉浓度升高对泥鳅生长的抑制逐渐增强,当浓度达到200 mg·L?1时,HH1组和MH63对照组泥鳅的特定生长率、内脏系数与CAT活性降低。研究结果表明,水体中低含量的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻HH1稻秆粉对泥鳅的生长与生理酶活性没有明显影响,高浓度HH1和MH63稻秆粉均使泥鳅的生长和生理酶活性显著降低,这可能与养殖水体中浓度较高的悬浮稻秆粉妨碍了泥鳅的呼吸和滤食,及稻秆粉的分解降低了水体p H和溶氧量有关。

转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎生长发育的影响

测定了转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎的致死作用及生长发育的影响。结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫具有一定程度的控制作用,但不理想;转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫的生长发育有较大的影响,表现为使各虫态发育历期延长,化蛹时间和羽化时间延长,幼虫虫体质量和蛹质量减轻,化蛹率和羽化率明显降低。

转Cry1Ac+Cry2Ab棉花生长势及其对棉田节肢动物物种丰富度的影响

【背景】转基因棉花在商业化种植之前,必须评价其环境安全性。其中新型棉花材料的生存竞争能力和对物种丰富度的影响是评价的重要内容。【方法】以转Cry1Ac＋Cry2Ab基因棉为试验材料,转Cry1Ac棉花中棉所41和非转基因棉花中棉所49为对照品种,分别于2014年5~9月对棉花株高、主茎叶片数、叶绿素含量、比叶面积、果枝数、蕾铃数等生长参数进行比较,同时对二代、三代和四代棉铃虫发生期棉田物种丰富度进行系统调查。【结果】转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花的生长势与转Cry1Ac棉花和非转基因棉花基本相当,没有表现出明显的竞争优势;产量构成参数在成铃和脱落等方面比非转基因棉表现出良好的优势。对棉田节肢动物物种丰富度的影响表明,转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花对靶标害虫棉铃虫具有良好的控制效果,对主要刺吸性害虫棉蚜、棉蓟马、烟粉虱、绿盲蝽与天敌龟纹瓢虫、草间小黑蛛、草蛉和小花蝽等的种群丰富度在个别时期有所影响,但总体上与转Cry1Ac棉田和非转基因棉田没有显著性差异。【结论与意义】转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花无竞争优势,但目标性状优势较好;对棉田节肢动物物种丰富度无明显影响。研究结果为新型转Cry1Ac＋Cry2Ab棉花对棉田环境安全方面的研究进一步补充了内容,为转基因棉花的环境安全评价提供科学数据。

高迁移率族蛋白1通过调控自噬因子P62调节心肌细胞纤维化

目的:探究高迁移率族蛋白1(HMGB1)通过调控自噬活性对心肌纤维化的影响及作用机制。方法:将人心肌细胞AC16培养于DMEM培养基中,用不同浓度的HMGB1(0、4、20、100μg/L)干预AC16细胞6 h,免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞活化的标志性蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平,Western blot法检测心肌自噬相关蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、磷酸肌醇-3-激酶3(PIK3C3)、可溶性及不可溶性P62、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)在AC16中的表达水平。免疫共沉淀检测α-SMA与P62之间的互相作用。结果:不同浓度的HMGB1刺激AC16细胞,AC16细胞中心肌纤维化标志蛋白CollagenⅠ与α-SMA的表达水平呈浓度依赖性升高,自噬蛋白PIK3C3、不可溶性P62的蛋白表达水平,p-mTOR与mTOR的比值,LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ的比值呈浓度依赖性升高,可溶性P62的蛋白表达水平呈浓度依赖性降低。各组间的差异均有统计学意义(P均<0.01)。免疫共沉淀实验显示P62与α-SMA存在相互作用。结论:外源性HMGB1可抑制AC16细胞中的自噬流,诱导AC16细胞纤维化。

转Cry1Ac+Cry2Ab棉对棉铃虫的控制作用及对天敌捕食烟粉虱功能反应的影响

文章以转Cry1Ac基因棉(中棉所41)和常规棉(中棉所49)为对照,研究了转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉(639020)在棉花生长的关键时期——蕾期(二代棉铃虫发生期)、花期(三代棉铃虫发生期)和花铃期(四代棉铃虫发生期)对棉铃虫的控制作用,同时研究了639020棉田主要捕食性天敌(中华草蛉幼虫、龟纹瓢虫、小花蝽和草间小黑蛛)对烟粉虱的捕食功能,明确了639020棉花在生长的关键时期对棉铃虫的控制效果及对棉田主要捕食性天敌捕食功能反应的影响。结果表明,639020棉花对二代和三代棉铃虫具有良好的控制作用,抗虫性分别比中棉所41提高了52.85%和16.22%,其中前者差异达显著水平,后者差异不显著。在棉花蕾期、花期和花铃期,639020棉田棉铃虫落卵量都比中棉所41棉田和中棉所49棉田低(除二代棉铃虫发生期);棉铃虫幼虫数量都极显著低于常规棉,且都低于防治指标,但与中棉所41棉田无显著差异。639020棉田中华草蛉、龟纹瓢虫、小花蝽和草间小黑蛛对烟粉虱的捕食功能与中棉所41棉田和常规棉田相比无显著变化。研究结果以期为新型转基因棉花环境安全性研究及其外源基因的抗虫遗传效应和生产应用前景进行安全性评价。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花对天敌生长发育的影响

以转Cry1Ac基因棉和常规棉品种为对照,系统研究了转Cry1Ac+Cry2Ab棉花对小花蝽、龟纹瓢虫和中华草蛉生长发育的影响。结果表明,和常规棉品种相比,饲喂取食转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉和转Cry1Ac基因棉品种叶片的棉铃虫初孵幼虫使各天敌不同龄期的生长发育历期均有所延长,前者延长的历期短,后者延长的历期长,但差异均未达显著水平。

转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。