苏云金芽孢杆菌Cry1Ca7蛋白定点突变对甜菜夜蛾杀虫活性的影响

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Ca7对重要的农业害虫甜菜夜蛾具有较高毒力。【目的】本文的研究目的是通过定点突变的方法获得毒力发生改变的毒蛋白,为下一步研究工作提供有价值的实验材料。【方法】利用重叠引物PCR技术对cry1Ca7基因进行定点突变,获得了10种突变基因,通过生物活性测定的方法确定了各突变基因表达产物对甜菜夜蛾的杀虫活性。【结果】活性降低的突变毒蛋白有G138S,T221D,T221R,N251S,439GGT440,N306R,W376F,R522E和R570G,其中,位于DomainⅡ内的突变的活性依次是439GGT440<N306R<W376F;位于DomainⅢ内的突变R522E<R570G,二者的活性较Cry1Ca7也有明显降低;只有位于结构域Ⅰ中的R148G,产生了活性提高的突变毒蛋白,其毒性较Cry1Ca7提高了6倍,而同样位于DomainⅠ内的突变T221D<T221R<G138S<N251S,尤其是T221D活性完全丧失。研究结果表明,在结构域Ⅰ中的突变更容易产生活性提高的突变蛋白,而结构域Ⅱ和Ⅲ较难获得毒力提高的突变蛋白。【结论】本项研究所获得的这些活性发生不同变化的蛋白为揭示Cry蛋白的杀虫机理提供了基础材料,而活性提高的诱变基因及其表达产物将可作为新的杀虫资源,用于抗虫遗传工程菌和转基因植物的构建。

鳢肠乙醇粗提物与Cry1Ca的协同增效及对甜菜夜蛾SeABCC1―SeABCC3 mRNA表达量的影响

本试验旨在明确鳢肠Eclipta prostrata乙醇粗提物与Bt毒素Cry1Ca防治甜菜夜蛾Spodoptera exigua的协同增效作用,及对甜菜夜蛾转运蛋白C(SeABCC1―SeABCC3)m RNA表达量的影响。结果表明,鳢肠乙醇粗提物对甜菜夜蛾2龄幼虫具有明显毒杀作用,喂食5.26 mg/cm2鳢肠乙醇粗提物7 d后,幼虫死亡率为58.4%;喂食鳢肠乙醇粗提物(LD_(30))与Cry1Ca(LD_(30))混合物3、5和7 d死亡率分别为59.72%、73.61%和83.33%,但仅喂食Cry1Ca(LD_(30))死亡率分别为5.6%、13.9%和31.9%,仅喂食鳢肠乙醇粗提物(LD_(30))死亡率分别为21.8%、28.7%和30.1%,鳢肠乙醇粗提物与Cry1Ca的协同增效作用显著;qPCR分析SeABCC1―SeABCC3 mRNA表达量变化,经鳢肠乙醇粗提物(LD_(30))处理后SeABCC1、SeABCC2和SeABCC3表达量升高,引起甜菜夜蛾幼虫对Cry1Ca的敏感性升高。综上所述,鳢肠乙醇粗提物可作为植物源农药与Bt毒素混配使用,提高对甜菜夜蛾的防治效果。

水稻密码子优化的cry1Ca基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1Ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免疫家兔获得了滴度(ELISA)为l∶50 000的抗血清,并具有较强的特异性。

对甜菜夜蛾具有杀虫活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

根据已报道的14个cry1Ca基因,设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析,结果获得5种类型酶切图谱,表明这些菌株分为5种类型。SDS-PAGE结果显示22株菌均表达约130ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白,经胰蛋白酶活化,对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]进行初步生测,结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC_(50)的测定,结果证实它们均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087μg/g)、B16-C8(0.103μg/g)、T1-B8(0.202μg/g)的活性与阳性对照菌株G03(0.090μg/g)相当,具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。

苏云金芽孢杆菌Cry1Aa和Cry1Ca结构域交换对晶体形态和杀虫活性影响

通过体外重组的方法，实现了苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白Cry1Aa和Cry1Ca的功能性结构域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的互换，得到了6株苏云金杆菌重组菌株BT-ACC，BT-AAC，BT-ACA，BT-CAA，BT-CCA和BT-CAC。SDS-PAGE和Westem blot分析表明，重组菌株BT-CAA和BT-CCA能表达产生135kDa左右的杂交晶体蛋白Cry1CAA和Cry1CCA，但其蛋白表达量较野生型Cry1Aa和Cry1Ca低。用牛胰蛋白酶对杂交晶体蛋白Cry1CAA、Cry1CCA及野生型Cry1Aa和Cry1Ca进行消化，证明所有晶体蛋白都能产生65kDa的活性毒素。电镜观察发现，野生菌株BT-Cry1Aa和BT-Cry1Ca形成典型的菱形晶体，而重组菌株BT-CCA和BT-CAA则形成球形或颗粒状杂交晶体。纯化晶体的生物测定显示，杂交晶体蛋白Cry1CAA和Cry1CCA对甜菜夜蛾的毒力比野生型晶体蛋白降低3—5倍，对棉铃虫的毒力比野生型晶体蛋白降低了190—260倍。研究结果表明，苏云金杆菌晶体蛋白不同结构域的相互作用会影响杂交晶体蛋白的表达、晶体形态和杀虫活性。

辛硫磷与Cry1Ca的协同增效及对甜菜夜蛾SeALP mRNA转录水平的影响

本试验旨在明确辛硫磷(Phoxim)与Bt蛋白Cry1Ca防治甜菜夜蛾Spodoptera exigua的协同增效作用,及对甜菜夜蛾碱性磷酸酯酶(SeALP) mRNA转录水平的影响。结果表明,与空白对照处理相比,喂食辛硫磷(LC30)与Cry1Ca (LC30)混合物的甜菜夜蛾幼虫历期、蛹历期延长,并且在处理后3、5、7 d的实际死亡率分别为52. 73%、93. 13%、95. 87%;但仅喂食辛硫磷(LC30)死亡率分别为30. 67%、44. 67%、45%,仅喂食Cry1Ca (LC30)死亡率分别为0. 00%、17. 73%、17. 73%,因此辛硫磷与Cry1Ca对防治甜菜夜蛾的协同增效作用显著。qPCR分析SeALP mRNA转录水平的变化,发现甜菜夜蛾SeALP1的转录水平随取食时间推移呈先升高后降低的趋势,SeALP2-SeALP5的转录呈先降低后升高的趋势。综上所述,辛硫磷与Bt蛋白混配可提高对甜菜夜蛾的防治效果,研究结果有助于阐明甜菜夜蛾抗性产生原因及机理,并为农药减量增效技术的研发提供科学依据。

斜纹夜蛾取食Cry1Ca蛋白后中肠组织病理变化

Cry1Ca对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾等多种鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性,它在转多种Bt蛋白基因策略中,可用于扩大杀虫谱,并可用于当前Bt蛋白的抗性治理,是极具潜力蛋白之一。为明确Cry1Ca对斜纹夜蛾的作用机制,我们利用透射电镜观察了幼虫取食Cry1Ca后中肠组织的病理变化。结果表明斜纹夜蛾取食含Cry1Ca蛋白的饲料2 h后中肠组织开始表现明显的病理变化,且随取食时间的增加病变越来越严重。具体表现为:中肠细胞微绒毛肿胀、扭曲、断裂和脱落;细胞核拉长或畸形、核膜模糊、染色质不均匀或聚集;线粒体变形、空泡化和内脊模糊不清;内质网杂乱无章、肿胀变形和数量变少。研究结果可为更好地利用Cry1Ca防治斜纹夜蛾提供理论依据。

转Cry1Ca和Bar基因水稻的获得与性状鉴定

本研究以光温敏核不育系P88S为受体材料,用农杆菌法进行转化,并对获得的转基因植株进行分子鉴定及性状鉴定。结果显示:Bar基因和Cry1Ca基因在水稻P88S中成功整合并表达。光温敏核不育系P88S经过转基因后育性发生改变,表现出一定的可育度。转基因后P88S的谷粒宽及千粒重与对照之间的差异达到了极显著水平。

二化螟响应Bt杀虫蛋白Cry1Ca的小RNA转录组分析

为有效防控二化螟Chilo suppressalis,采用Illumina Solexa二代测序技术对Bt杀虫蛋白Cry1Ca处理后二化螟中肠内的小RNA序列进行测序,并对其差异表达谱进行注释与分析,并用实时荧光定量PCR技术对测序结果进行验证。结果显示,Cry1Ca对二化螟的亚致死量LC30为0.061μg/g。Cry1Ca处理和对照处理后转录组中小RNA分布峰值均为22 nt,被注释的已知小RNA比例很低,分别为7.2%和7.9%。Cry1Ca处理后,二化螟中肠内miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、piRNA数量均少于对照。与对照相比,Cry1Ca处理后二化螟中肠内共有358个小RNA表达上调,747个小RNA表达下调,其中有25个已知miRNA的表达量较高,其中3个已知miRNA表达量显著上调,22个已知miRNA表达量显著下调;在新预测的novel miRNA中,有23个上调表达,43个下调表达。KEGG分析结果显示,Cry1Ca诱导的miRNA影响了丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路,这个通路包含17个靶基因,其中11个靶基因可被多个miRNA调控,每个靶基因可被59~665个miRNA靶向调控,参与靶向调控miRNA的相对表达量变化倍数介于0.01倍~23289倍之间,表明miRNA在调控二化螟防御Bt杀虫蛋白Cry1Ca方面发挥着重要作用。实时荧光定量PCR的结果与测序结果一致,表明测序结果正确。