农杆菌介导的转Pta-CrylAc番茄的优化体系

本实验采用根癌农杆菌介导的双价抗虫基因Pta-CrylAc转化方法,针对于番茄品系的Micro-Tom进行转化,优化了农杆菌介导番茄转化的几个影响因素:①外植体长度在0.5 cm左右有利于愈伤组织的形成;②农杆菌侵染时间为8 min;③菌液浓度OD600约为0.15。

转CrylAc+CpTI双价基因棉对烟粉虱主要解毒酶活性的影响

测定了取食转双价基因棉SGK321及其亲本棉SY321后烟粉虱伪蛹体内羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶等主要解毒酶的活性。结果表明：与SY321烟粉虱种群相比，SGK321对烟粉虱体内羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶活性均值元显著影响，但两个种群中这些酶活性个体分布存在不同程度的差异。与SY321烟粉虱种群相比，SGK321烟粉虱种群α-NA羧酸酯酶活性在〈30mOD／（mg protein·min）区间分布频率较高，而在30-40mOD／（mg protein·min）区间较低；SGK321烟粉虱种群乙酰胆碱酯酶活性在2～4U／mg protein区间内分布频率略低，而在〉4U／mg protein区间内分布频率上升了10个百分点；SGK321烟粉虱种群谷胱甘肽S-转移酶活性在80～140U／mg protein活性区间内分布频率略有下降，在140～170U／mg protein区间内分布频率上升了15个百分点。

两种转Bt基因棉杀虫蛋白Cry1Ac表达量的检测

用EnvirologixCry1Ab/Cry1Ac平板试剂盒检测了两种转Cry1Ac基因的棉花品系 (NUCOTN33B、NUCOTN99B) 以及常规对照品系 (苏棉 12) 不同生育期主茎嫩叶、侧枝嫩叶、蕾及蕾的苞叶中杀虫蛋白Cry1Ac的含量。结果表明, 两种转Bt基因棉主茎嫩叶杀虫蛋白Cry1Ac的含量随生育期的推移呈明显下降趋势, 花铃期 (NUCOTN33B和NUCOTN99B分别为 4 43和 2 93μg·g-1 ) 和吐絮期 (3 87和 2 86μg·g-1 ) 的含量分别降至苗期第 6叶 (7 64和 8 38μg·g-1 )的 58%、35%和 51%、34%; 相同时期的主茎嫩叶和侧枝嫩叶中Cry1Ac的含量均显著高于蕾及蕾的苞叶, 前两者均为后两者的两倍以上。

转cry1Ac和CpTI双基因抗虫水稻对二化螟和大螟的致死效应及田间螟虫构成的影响

就转crylAc＋CpTI双基因抗虫水稻不同生育期对二化螟Chilo suppressalis和大螟Sesamia inferens的室内致死特性及田间螟虫的构成进行了研究。室内测定结果表明，不同生育期转基因水稻对二化螟、大螟都表现明显的致死效应，但水稻生长后期的致死效果降低。转基因水稻对大螟的致死效应显著弱于对二化螟的，其中，二化螟除在齐穗期和成熟期有少量幼虫（0．5％～6．4％）存活到第4天外，其余均在第4天死亡；大螟在两种转基因水稻上的存活率高于二化螟，且少量个体（〈1．6％）还能化蛹、羽化，但化蛹率和羽化率均明显低于在非转基因对照上的。早、晚两季水稻的田间调查结果表明，转基因水稻上两种螟虫虫口数量均显著低于相应的非转基因对照品种，转基因水稻上二化螟虫口减退率〉99％；大螟虫口减退率相对较低，早、晚稻上有所不同，其中早稻〉93％，晚稻仅44％～64％。转基因水稻上残存螟虫中，大螟所占比例明显上升，推测转基因水稻对两种螟虫致死效应差异可能是其主要原因。

转sck单价基因和cry1Ac/sck双价基因水稻对二化螟的致死效应及中肠组织病理变化观察

室内采用离体叶片法研究了转sck单价基因抗虫水稻86AS1和转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻MSB不同生育期主茎顶叶对二化螟幼虫的杀虫效果.结果发现,不同生育期的MSB对二化螟初孵幼虫表现出了很强的毒杀效果,二化螟幼虫校正死亡率在扬花期前均达到90%以上;扬花期和灌浆期抗虫性有所下降,校正死亡率高于80%;成熟期校正死亡率在60%以上.在整个生育期,二化螟幼虫取食86AS1主茎顶叶的校正死亡率均未超过50%.MSB对二化螟幼虫的毒杀效果明显高于86AS1.采用透射电镜观察二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻和转sck单价基因抗虫水稻主茎顶叶后中肠组织的病理变化.结果发现,两种转基因水稻都能够引起二化螟幼虫中肠组织发生病理变化,但病变程度有明显差异.二化螟幼虫取食转cry1Ac/sck双价基因抗虫水稻3d,中肠组织受到严重破坏且病理变化明显;取食转sck单价基因抗虫水稻3d,幼虫中肠组织的病理变化却较缓慢.

转Cry1Ac+CpTI基因棉对棉田害虫及其天敌种群动态的影响

20 0 2年在河北省南皮县对转Cry1Ac+CpTI基因棉 (SGK32 1)棉田害虫及其天敌种群动态的研究结果表明 ,SGK32 1棉田及其亲本对照棉 (石远 32 1)棉田的害虫和捕食性天敌的种类基本相同 ,但数量差异较大。但在 5月 2 3日至 9月 16日的 2 4次调查中 ,SGK32 1棉田的 5种主要害虫棉铃虫、棉蚜、绿盲蝽、棉粉虱、小绿叶蝉的总数量分别较其亲本石远 32 1棉田降低89 5 %、6 4 5 %、2 1 8%、15 6 %和 33 7%。SGK32 1棉田龟纹瓢虫和中华草蛉的种群总数量分别比石远 32 1棉田增高 34 0 %和9 1% ,但异色瓢虫、小花蝽、异须盲蝽、蚜茧蜂和蜘蛛类的种群数量分别降低 2 8 6 %、6 5 %、4 3 1%、4 4 7%和 14 0 %。主要害虫和天敌种群动态的监测表明 ,棉蚜、小绿叶蝉和棉粉虱的发生高峰期分别为 7月中下旬 ,8月下旬至 9月中旬 ,8月下旬至 9月上、中旬。在三者的高峰期内 ,SGK32 1棉田的种群数量基本上低于对照田。龟纹瓢虫的发生高峰期为 7月上旬到 8月上、中旬 ,且SGK32 1棉田的种群数量高于对照田。研究表明 ,SGK32 1在对棉铃虫具有很好抗性的同时 ,对棉蚜、棉粉虱、绿盲蝽、小绿叶蝉等非靶标害虫的发生也有一定的抑制作用 ;SGK32 1棉田龟纹瓢虫和中华草蛉的种群数量增加 ,其他主要天敌的数量则有所降低 ,表明SGK32

Bt Cry1Ac毒素筛选的粉纹夜蛾离体抗性细胞与敏感细胞蛋白质组的差异分析

采用双向电泳技术和肽质量指纹图谱技术分析了BtCry1Ac毒素筛选的粉纹夜蛾Trichoplusiani抗性BTI_Tn_5B1_4细胞与同源敏感细胞的蛋白质组的差异。用MelanieViewerⅡ软件在抗性细胞的双向电泳图谱上检测到的平均蛋白质点数为 70 7± 2 5个 (n =3) ,在敏感细胞的双向电泳图谱上检测到的平均蛋白质点数为 6 37± 19个 (n =3) ,其中分辨率高、重复性良好的显著差异点有 10余个。对其中的一个敏感细胞特有的显著差异斑点进行了肽质量指纹图谱分析 ,经数据库查询表明该蛋白质与胞质外周蛋白具有同源性。

转Cry1Ac/CpTI栽培稻外源基因渗入普通野生稻中可稳定的遗传和表达

转基因水稻的研发以及环境释放,外源基因通过花粉逃逸到野生近缘种中,可能带来的生态效应愈来愈受到人们的关注。本研究采用人工杂交技术将Cry1Ac/CpTI双价抗虫基因从转基因栽培稻渗入普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)中,获得普通野生稻F1及分离后代F2、F3、F4、F5和回交后代BC1F1和BC1F2,并对渗入外源基因的普通野生稻中的外源基因的遗传和表达进行了分析,试图阐明转基因栽培水稻外源基因的逃逸,可能在近缘野生栽培稻中稳定遗传的事实。研究结果显示:在野生栽培稻中外源基因的拷贝数与转基因的供体栽培稻完全一致。外源基因在普通野生稻中传代过程中插入位点的遗传也是稳定的。Cry1Ac杀虫蛋白在野生稻的不同世代中的表达模式和表达量与其转基因的供体栽培稻大致一致。本研究说明,转基因水稻外源基因一旦逃逸,有可能渗入近缘野生稻中,并在近缘野生稻中可稳定的遗传与表达,但转基因水稻外源基因逃逸是否对其近缘物种造成非预期生态效应还需要进一步对其进行生态适合度评价。

抗苏云金杆菌毒素Cry1Ac粉纹夜蛾细胞系的特性研究

为了从离体细胞水平探讨昆虫对苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的部分抗性机制,本文采用活化的Cry1Ac 毒素对粉纹夜蛾BTI-TN-581-4细胞连续筛选86代,获得了高水平抗性细胞,研究了其某些特性。它对Cry1c 产生了低水平的交互抗性,对低渗溶液的耐受性显著增强,双向电泳图谱表明抗性细胞膜蛋白组分发生了明显的变化。膜蛋白组分的变化可能导致了筛选细胞的耐低渗透压和抗Cry1C。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉与转Cry1Ac+EPSPS基因棉在黄萎病菌压力环境下检测技术和生存竞争能力研究

旨在研究2种转双价基因棉在棉黄萎病菌压力环境下的生存竞争能力。以‘赣棉杂1号’和‘赣棉11号’为对照,在黄萎病圃检测转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉、转Cry1Ac+EPSPS基因棉发病情况、生长和产量竞争能力。2个转双价基因棉抗黄萎病性不显著的强于2个对照;转Cry1Ac+EPSPS基因棉株高、覆盖度增长竞争能力相对较强,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉相对较弱;转Cry1Ac+EPSPS基因棉的单株成铃和果枝层数较高,增长竞争能力也较强,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉较弱;2个转双价基因棉最后的脱落率与2个对照差异不显著;转Cry1Ac+EPSPS基因棉籽棉、皮棉产量介于2个对照之间,而转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉的产量低于2个对照。转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉推广种植可行性相对较差,转Cry1Ac+EPSPS基因棉推广种植可行性一般。

Cry1 Ac基因组织特异表达载体构建及水稻遗传转化

为了提高转基因抗虫水稻的生物安全性,构建了由组织特异性启动子序列RSP1、RSP2及组成型启动子35S带动Bt基因Cry1Ac的双元载体pCAM RSP1 Cry1A(c)、pCAM RSP2 Cry1A(c)及pCAM 35S Cry1A(c),并通过农杆菌EHA105介导对两个水稻品种"秀水11"和"秀水63"进行了遗传转化。"秀水11"和"秀水63"的平均转化率分别为72 9%和83 2%,经抗性愈伤组织的分化培养两个品种分别获得346和448株再生植株,其中PCR检测阳性株数分别为295和414。

转双价抗虫基因棉花的主要农艺性状的遗传变异

以11个转外源基因(Cry1Ac+API-B)系为材料,受体亲本陆地棉品种鄂抗9号为对照,研究其在抗棉铃虫性、产量和纤维品质性状上的差异。结果表明:11个转基因系的抗棉铃虫效果明显,达到中抗和高抗水平;转基因系及其受体、转基因系之间在单铃重等10个性状上均存在极显著性差异;和受体亲本相比,各个转基因系变异方向比较一致的性状有:衣指、衣分降低;而株高、单株结铃数、单铃重、子指、皮棉产量、纤维长度、断裂比强度、马克隆值、伸长率等性状的变化方向不定。

Cry1Ac杀虫蛋白对粘虫中肠几种酶活性的影响

为阐明Bt杀虫蛋白对次要靶标害虫粘虫Mythimna separata(Walker)(鳞翅目:夜蛾科)的生理学影响,本研究分析比较了粘虫高龄幼虫在室内取食低剂量Cry1Ac杀虫蛋白6,12,24和36h后,其体内主要的解毒酶(酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶)、保护酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)和中肠蛋白酶(总蛋白酶、强碱性类胰蛋白酶、弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶)等活性的变化。结果表明,取食Cry1Ac杀虫蛋白后,粘虫幼虫体内相关酶活力呈现不同的变化趋势:(1)酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶(POD)、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活力较对照显著降低(P<0.05);(2)超氧化物歧化酶(SOD)活力较对照显著升高(P<0.05);(3)过氧化氢酶(CAT)活力于6,12和24h显著低于对照(P<0.05),36h时显著高于对照(P<0.05)。结果提示Cry1Ac杀虫蛋白主要通过抑制粘虫幼虫中肠解毒酶和蛋白酶的活性,扰乱SOD,CAT和POD3种保护酶的动态平衡而干扰幼虫的正常生理代谢,从而起到毒杀粘虫的作用。

外源基因在苏云金杆菌染色体上的定点整合及表达

【目的】研究构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)工程菌的方法。在构建Bt工程菌时,高拷贝外源质粒的转入导致Bt芽孢数量减少,芽孢形成期延滞,影响Bt菌株的杀虫活力。而且,外源质粒在Bt中的稳定性较差,外源基因容易丢失。将基因整合入染色体是一种构建遗传性状稳定、杀虫活力高的Bt工程菌的有效方法。【方法】本研究采用PCR技术,分两段扩增定位于Bt无晶体突变株XBU001染色体上的trigger factor基因片段作为同源臂,克隆入温度敏感型载体pKSV7,构建了定点整合载体pKTF12。并利用pKTF12质粒将cry1Ac基因定点整合入XBU001染色体上。【结果】利用载体pKTF12将cry1Ac定点插入triggerfactor位点,对宿主菌XBU001的正常生长没有影响。重组菌株KCTF12中的cry1Ac基因能够稳定遗传、表达并形成菱形晶体。与携带高拷贝外源质粒的Bt菌株HTX42相比较,KCTF12具有芽孢数量增多、芽孢形成期提前的优势。【结论】定点整合法是一种构建稳定表达外源基因、无抗性标记基因Bt工程菌的有效方法。

Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测技术研究

通过苏云金芽孢杆菌(Bt)HD-73培养,提取Bt晶体蛋白Cry1Ac,经酶解后获得高抗虫活性蛋白。免疫新西兰白兔得到高纯度的Bt晶体蛋白1Ac抗体,用125I标记抗原,研究和建立了Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测技术,该试剂盒用磁性微粒作分离剂,不需离心即可分离,简化了测定步骤,检测结果达到国外同类产品(酶联免疫试剂盒)的水平。

低温对转Bt基因棉杀虫蛋白表达及其氮代谢的影响

以2个转Bt基因抗虫棉,泗抗1号(常规种)、泗抗3号(杂交种)为材料,研究了低温对转Bt基因抗虫棉叶片中杀虫蛋白表达量和氮代谢的影响。2007年,于盛蕾期、盛花期、盛铃期,将盆栽棉花18℃低温下处理24 h。2008年,在18℃低温下处理48 h。研究结果表明,低温胁迫显著降低转Bt基因抗虫棉品种叶片中杀虫蛋白表达量。但盛铃期,下降幅度最大。其中低温胁迫24 h后,泗抗1号下降23.7%,泗抗3号下降28.1%;低温胁迫48 h后,2个品种分别下降52.9%和47.6%。叶片中丙酮酸转氨酶(GPT)活性、游离氨基酸、可溶性蛋白含量与蛋白酶活性在低温胁迫下表现相同趋势。以上结果表明,低温可能导致叶片可溶性蛋白的合成量降低,从而导致杀虫蛋白表达水平的下降。但对可溶性蛋白的分解并未有明显影响。

转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂生长发育的影响

研究了取食转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂的影响,主要包括意大利蜜蜂的生长发育、体内酶活性的变化.结果发现,取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂与取食非转基因亲本棉花花粉的蜜蜂(CK)相比,4、5、6日龄幼虫体重差异不显著,幼虫及蛹的历期也没有明显差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂6日龄幼虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶、总蛋白酶活力与CK相比,没有显著差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶活力极显著高于CK,强碱性、弱碱性类胰蛋白酶活力极显著低于CK,类胰凝乳蛋白酶活力显著低于CK.另外,采用酶联免疫(ELISA)方法在取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的蜜蜂6日龄幼虫体内能够检测到Bt杀虫蛋白.