竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。

铜对Ctr1基因mRNA表达的影响

采用半定量RT-PCR法检测铜对猪传代肾细胞(PK15)中特异性铜转运蛋白Ctr1基因mRNA表达水平的影响,以β-actin为内参考,对各试验组cDNA同时进行PCR扩增。结果,猪肾PK15细胞/%1基因mRNA表达量在7.8～31.2μmoL.L-1 Cu范围内随铜添加浓度的升高减少,当铜添加浓度达到62.5μmoL.L-1时,其表达量又有所回升,呈双相反应。

甜瓜乙烯信号转导途径关键因子基因CTR1的克隆及表达特性分析

在拟南芥中,CTR1在乙烯信号转导途径中发挥重要的负调控作用。目前的研究表明,在拟南芥中只存在一个CTR1基因。利用RT-PCR技术从甜瓜果实中克隆得到CTR1基因cDNA(Cm-CTR1)。Cm-CTR1 cDNA全长2 613 bp,编码870个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析表明,所克隆的甜瓜CTR1基因与拟南芥CTR1基因相似度为53.69%。Cm-CTR1的C-末端具有明显的类似于哺乳动物和果蝇中的Raf(retro-viral protein,V-raf)蛋白激酶家族的丝/苏氨酸蛋白激酶(Serine/threonine protein kinase)的特征。该结构具有所有已知蛋白激酶所共有的11个亚结构域,其中包括ATP结合位点和丝/苏氨酸蛋白激酶位点结构域,说明CmCTR1与其他植物CTR1相似。实时荧光定量PCR分析结果表明,从授粉后第15天到第20天,甜瓜果实Cm-CTR1基因表达量显著增加,第20天的表达量是第15天的2.5倍,之后表达水平趋于稳定,第40天到第45天表达量有所下降。

Ctr1基因mRNA转录水平与细胞内铜离子浓度的相关性

目的分析铜特异性转运蛋白(Ctr1)基因mRNA转录水平与细胞内铜离子浓度的相关性。方法从猪传代肾细胞PK15中扩增Ctr1基因,克隆并测序;采用半定量RT-PCR法检测不同浓度铜离子(0、7.8、15.6、31.2和62.5μmol/L)对PK15细胞中Ctr1基因mRNA转录水平的影响,以β-actin为内参;采用原子吸收光谱分析法检测细胞内铜离子的浓度。结果所扩增的Ctr1基因与GenBank公布的序列同源性达到98%;PK15细胞Ctr1基因mRNA的转录水平在铜添加量在7.8～62.5μmol/L范围内呈双相反应,各试验组Ctr1基因转录水平均低于0μmol/L;而细胞内铜离子浓度均高于0μmol/L,以Ⅳ组含量最高,且与其他各组差异有统计学意义。结论 Ctr1基因mRNA的转录水平与细胞内铜离子浓度呈负相关。

甘蔗乙烯信号转导途径关键基因CTR1的克隆与表达分析

为了研究CTR1基因与甘蔗糖分积累的关系,本研究利用同源克隆的方法,以甘蔗品种‘桂糖28’(GT28)幼嫩叶片的cDNA为模板,成功克隆得到2103 bp的甘蔗CTR1基因(ScCTR1;GenBank登录号为MK158246)。ScCTR1基因的开放阅读框(ORF)序列长1656 bp,编码551个氨基酸,预测蛋白质的分子质量为62.78 kD。ScCTR1蛋白具有CTR1同源蛋白典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。实时荧光定量PCR结果表明,ScCTR1基因在茎和叶中都有表达,在茎中其表达量呈先增加后降低的趋势,在未成熟叶、成熟叶和老叶中,其基因表达呈降低的趋势。本研究结果对阐明乙烯调控甘蔗茎糖分积累和叶发育的机理提供了重要的参考依据。