模拟微重力条件下新生大鼠心肌细胞三维培养体系的构建

目的 研究模拟微重力条件下构建新生大鼠心肌细胞三维培养体系的方法。 方法 分离新生大鼠原代心肌细胞 ,接种于聚乳酸 (PL A)支架材料上 ,经搅拌瓶培养 2 4小时后转入旋转式细胞培养系统 ,用倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察心肌细胞在支架上的生长情况 ,以四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法检测细胞活性。 结果 心肌细胞在 PL A支架材料上贴壁、伸展 ,融合成片 ,保持持续的代谢活性 ,发现 PL A-心肌细胞复合构造物的搏动。结论 接种于 PL A支架材料上的原代心肌细胞 ,在旋转式细胞培养系统的模拟微重力条件下 ,可以进行较理想的三维培养。

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的:探讨更为简便的新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的数量、存活率和纯度。方法:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化,分离新生大鼠心肌细胞,进行体外培养,观察心肌细胞形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定。结果:心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上。结论:改良的细胞培养技术可获得生长状态良好的心肌细胞。

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进

探讨更为简单的SD大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度,为临床应用建立心肌细胞模型.取出生24 h内SD大鼠的左心室,剪碎、消化、分离和纯化,进行培养,0.1 g/L胰酶消化,可以分离到形态完整、贴壁生长的心肌细胞.进一步通过离心、差速贴壁和化学试剂抑制非心肌细胞生长,纯化得到95%以上的心肌细胞.成功建立了心肌细胞体外培养模型,获得了高纯度的心肌细胞.

新生大鼠心肌细胞的分离和培养

为获得高纯度和高存活率的心肌细胞,探索心肌细胞大量培养的条件,并为进一步研究心肌细胞的细胞生物学特性奠定基础,同时为生理学和药理学研究提供细胞来源,试验采用胰蛋白酶顺序消化法及差速贴壁法,从1～2d龄新生大鼠的心肌组织中分离心肌细胞,观测心肌细胞的形态、结构、搏动状态和反映心肌细胞代谢状况的生化参数。结果表明,分离所得的心肌细胞纯度高,培养第3天就开始自发搏动,后连接成片,进而同步收缩;心肌细胞的亚显微结构包括肌丝、Z线、线粒体和大量糖原颗粒,葡萄糖比消耗率为7.44nmol/(个·d),乳酸比产率为3.83nmol/(个·d),乳酸转化率为51%,细胞代谢非常旺盛,说明试验培养条件有利于心肌细胞的气体交换和营养物质的摄取,从而有利于心肌细胞的生长。

新生大鼠心肌细胞体外培养及其与心肌成纤维细胞形态比较

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,比较心肌细胞和成纤维细胞的形态差异。方法胰蛋白酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行体外培养,差速贴壁法纯化心肌细胞,倒置显微镜跟踪观察心肌细胞的生长及搏动情况,台盼兰负染法检测心肌细胞活力,通过HE染色观察心肌细胞和成纤维细胞的形态学差异。结果接种24 h后细胞全部贴壁,部分细胞开始自发性搏动,48 h后,细胞体积增大,并伸出伪足,形状以三角形和梭形为主,3 d后细胞聚集成片并同步搏动且细胞活力均在90%以上。心肌细胞为梭形或三角形,胞质致密,多为单核细胞;心肌成纤维细胞呈泡状,双核和三核细胞较多,培养过程中不发生搏动。结论胰蛋白酶消化法培养新生大鼠心肌细胞快速有效,差速贴壁法纯化的心肌细胞可用于实验研究。

迷走神经结状神经节与心肌细胞联合培养的活细胞观察

用新生大鼠的连走神经结状神经节与心肌细胞进行联合培养。在相差显微镜下观察了神经元的生长以及神经一肌肉连接的形成．结状神经书与心肌细胞联合培养72～96h可观察到神经突起的终未终止于搏动的心肌细胞表面．神经节组织块周围有许多突起在心肌细胞表面相互交织成网状．交叉的突起相互粘连在一起，终止于抢动的心肌细胞表面的一个突起移动可牵动邻近的交叉突起同．本研究首次建立了在体外培养中具有结状神经节神经支配的心肌细胞模型．

交感神经节在共同培养的心肌细胞诱导下神经元的生长和迁移

目的：探讨联合培养中大鼠心肌细胞对交感神经节神经元的生长和迁移的影响。方法：在体外建立大鼠交感神经节与心肌细胞联合培养的模型。用倒置相差显微镜观察交感神经节与心肌细胞联合培养不同时间的活细胞生长状况,计数神经纤维束的数目。并用Holmes还原银染色法计数神经元迁移的数目。结果：联合培养中由交感神经节组织块长出的神经纤维束数目、直径大于5μm的神经纤维束的数目以及由交感神经节组织块迁出的神经元的数目均较单纯交感神经节组织块培养的明显增加。结论：联合培养中分散的心肌细胞诱导培养的交感神经节神经元神经突起的生长和神经元向周围的迁移。

新生大鼠原代心肌细胞的培养与鉴定

目的:探索简单易行、成功率高的心肌细胞培养方法。方法:取新生大鼠心脏心尖部剪成1 mm×1 mm×1 mm大小进行体外组织块贴壁培养。结果:成功培养出原代心肌细胞,并能够传代。心肌细胞台盼蓝染色显示存活率>87%,免疫组化染色鉴定纯度>90%。结论:通过上述方法可获得较高存活率及纯度的心肌细胞,该培养方法简单易行,重复性好,符合实验需求。

收缩活动促进新生大鼠培养心室肌细胞的~3H-亮氨酸掺入和细胞生长

本工作应用培养的新生大鼠心室肌细胞,以~3H-亮氨酸掺入、细胞直径和细胞体积为指标,观察了收缩活动对心肌蛋白质合成速率及细胞生长的影响。在含10％血清的培养介质中,常钾搏动组的心肌细胞(CMC)的~3H-亮氨酸掺入显著高于高钾停搏组的心肌细胞(QMC),24h的掺入量分别为1229±29与1076±60cpm/10~5细胞(每组n=5,P<0.01),CMC掺入为QMC的114.2％。QMC组细胞直径和体积分别为15.14±0.42μm和1842±123μm^3,而CMC组为16.82±0.64μm和2495±210μm^3,分别比前者高11.1％和35.5％(P<0.01,每组n=6)。这些变化随培养时间的延长更趋明显,但两组间的细胞数目并无显著差异(P>0.05)。上述结果表明:收缩活动本身能促进心肌细胞蛋白质合成和细胞生长。

新生SD大鼠心肌细胞分离培养的快速简单方法及鉴定

目的:探讨心肌组织块体外原代培养新生大鼠心肌细胞的方法。方法:将剪成1mm3左右小块心肌组织,采用体外贴块种植原代培养新生大鼠心肌细胞。结果:成功地培养出原代心肌细胞,并能够传代;倒置相差显微镜下证实培养的细胞为心肌细胞,免疫组化染色鉴定为心肌细胞特异性蛋白cTnT表达阳性,同时具有心肌细胞节律收缩特性。结论:心肌组织块体外原代培养操作简单,可以获得较多单个心肌细胞,所获得的细胞具有良好的功能状态。

成年大鼠心肌细胞的分离与培养

目的研究成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法。方法成年SD大鼠麻醉后，迅速开胸取心连接于Langendorff装置上进行逆行灌注，用0．06％-0．1％Ⅱ型胶原酶灌注消化分离心肌细胞，采用自然沉降法纯化心肌细胞，用改良M199培养基进行细胞培养。结果本方法可获得60％～85％具有活性的成年大鼠心室肌细胞，每只SD大鼠心脏的细胞产量可达1×10^7个。结论该方法简单、有效，同时具有一定的可控性。

蛋白激酶C和Na~＋－H~＋交换在ANGⅡ诱发心肌细胞肥大反应中的作用

血管紧张素（ＡＮＧ）Ⅱ在１０－１０－１０－６ｍｏｌ／Ｌ范围内剂量依赖性促进无血清培养新生大鼠心肌细胞蛋白质合成速率。蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（Ｓｔａｕ２ｎｍｏｌ／Ｌ）对心肌细胞基础状态３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入无明显影响，但Ｓｔａｕ预处理３０ｍｉｎ，则可有效阻断ＡＮＧⅡ（１μｍｏｌ／Ｌ）对细胞蛋白质合成的刺激作用；单纯应用ＰＫＣ激活剂ＰＭＡ（１μｍｏｌ／Ｌ）可使心肌细胞蛋白质合成速率增加，与对照组相比，ＰＭＡ组３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入量增加了４１．０４％。细胞Ｎａ＋－Ｈ＋交换抑制剂Ａｍｉｌｏｒｉｄｅ预处理也能阻断ＡＮＧⅡ刺激３Ｈ－Ｌｅｕｃｉｎｅ掺入细胞蛋白质的作用。以上结果提示ＰＫＣ和Ｎａ＋－Ｈ＋交换的激活，可能是ＡＮＧⅡ诱发的心肌细胞肥大反应的重要胞内信息转导机制。本工作还观察到，阻断细胞Ｎａ＋－Ｈ＋交换后并不影响由ＰＫＣ激活导致的蛋白质合成增加，提示可能存在着ＰＫＣ和Ｎａ＋－Ｈ＋交换彼此相对独立地调节心肌细胞生长的途径。

多用途成年大鼠心室肌细胞分离方法

目的建立稳定的可同时用于细胞培养和膜片钳实验的成年大鼠心室肌细胞的分离方法。方法应用Langendorff灌流,生物酶消化法分离耐钙心肌细胞。分别用左右心室肌做细胞培养和全细胞膜片钳研究。结果左室心肌细胞数(3.7±0.6)×106,杆状细胞得率(84.8±2.7)%。右室心肌细胞横纹清晰,折光率好,膜片钳实验时容易封接破膜,记录到典型的ICa.L、IK1、Ito、INa电流。结论该方法简单、节约、重复性好,改善了杆状细胞得率、细胞质量,左右心室肌细胞分别能很好地用于细胞培养和膜片钳实验。

乳鼠心肌细胞的体外三维培养

【目的】探讨应用PLGA泡沫支架材料,在体外建造组织工程化心肌组织的可行性。【方法】采用顺序消化及差速贴壁法分离纯化乳鼠心肌细胞,将分离所得的心肌细胞接种于PLGA多孔支架材料上,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和二维培养的心肌细胞进行比较。【结果】复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与二维培养的细胞相比,细胞代谢更加旺盛。【结论】采用组织工程技术有可能在体外培育出组织工程化心肌组织。

新生大鼠原代心肌细胞的培养

目的高效获得乳鼠原代心肌细胞。方法取新生24 h乳鼠心脏,剪碎后单独用质量分数为0.08%的胰蛋白酶进行多次消化、细胞洗涤获得心肌细胞。台盼蓝染色后观察心肌细胞存活率。以搏动细胞数占视野中细胞总数比例估测心肌细胞纯度。结果获得的原代心肌细胞存活率>85%、纯度>95%。结论通过上述方法可获得较高存活率及纯度的原代心肌细胞,该培养方法简单易行,重复性好,基本能满足实验要求。

AngⅡ对心肌细胞Kv4.2钾通道蛋白表达的影响及机制

【目的】体外培养新生大鼠心肌细胞,观察AngⅡ在诱导细胞肥厚过程中对Kv4.2蛋白表达的影响,及钙离子在其细胞内信号传导通路中的作用。【方法】建立AngⅡ致心肌细胞肥大模型,用激光共聚焦显微镜检测AngⅡ对心肌细胞胞浆钙离子浓度的影响,用流式细胞仪检测AngⅡ在诱导心肌细胞肥厚过程中细胞Kv4.2表达的变化。【结果】AngⅡ明显增加细胞的蛋白总量,诱导心肌细胞肥大,AngⅡ能增加心肌细胞胞浆钙离子浓度,下调Kv4.2编码的通道蛋白的表达含量。【结论】AngⅡ在诱导心肌细胞肥大过程中,可能通过细胞内钙离子以外的信号通路下调Ito通道蛋白Kv4.2。

改良的成年SD大鼠心室肌细胞分离与培养方法

目的建立稳定高效的成年大鼠心室肌细胞分离与培养方法。方法成年SD大鼠麻醉后,迅速开胸取心,将主动脉连接于Langendorff装置上进行逆向灌流,用0.8 mg/m LⅡ型胶原酶和0.1 mg/m L蛋白酶双酶灌注消化分离心肌细胞,采用自然沉降法纯化心室肌细胞,一部分细胞用改良的M199培养基进行细胞培养,另一部分使用台盼蓝染色进行细胞活性检测并计数,同时使用激光共聚焦显微镜观察细胞收缩及钙瞬变。结果本方法可获得(81.9±2.2)%具有活性的成年大鼠心室肌细胞,每只SD大鼠心脏的细胞产量可达(2.0±0.1)×107个,电刺激时细胞同步稳定收缩。结论该分离和培养方法高效、稳定,分离出的细胞活性高,产量高,可用于原代培养。

成年大鼠心肌微血管内皮细胞的分离与培养

目的本文建立一种简便、高效的成年大鼠心肌微血管内皮细胞分离及培养的方法。方法选取7~8周龄Wistar大鼠,麻醉后开胸取出心脏,采用离体心脏灌流和酶消化法进行心肌微血管内皮细胞的分离;取第3代细胞观察其增殖特征并绘制增殖曲线;用免疫细胞化学和免疫荧光对细胞的第Ⅷ因子相关抗原和CD31进行鉴定,利用基质胶检验其血管形成能力。结果体外培养心肌微血管内皮细胞呈多边形或梭形,具有典型的铺路石样生长特点;同时,第Ⅷ因子相关抗原和CD31呈阳性;具备血管形成能力。结论本方法培养的成年大鼠心肌微血管内皮细胞具有较高的纯度,方法简便易行,可用于心血管疾病基础及临床研究。

SD乳鼠心肌细胞原代培养及纯化方法的优化探索

目的通过对乳鼠心肌细胞原代培养及纯化方法的优化探索,寻找简单、有效的培养及纯化方法。方法 20只乳鼠随机分两组,A组采用酶消化法+吸管吹打获取心肌细胞;B组通过酶消化法+自制转子磁力搅拌获取心肌细胞。两组均采用差速贴壁和5-溴脱氧尿核苷(BrdU)纯化心肌细胞,免疫荧光法鉴定心肌细胞纯度,台盼蓝染色观察心肌细胞活性,显微镜下计数心肌细胞搏动性。结果 A组心肌细胞的存活率、搏动率、纯度分别为(89.90±2.92)%、(91.30±2.00)%和(94.90±1.79)%;B组分别为(94.70±2.31)%、(95.00±1.24)%和(95.60±1.43)%。B组心肌细胞活性及搏动率均高于A组,差异有统计学意义(P>0.05);B组的心肌细胞纯度稍高于A组,但差异无统计学意义(P>0.05)。BrdU加入后与未加入相比,抑制成纤维细胞的生长。结论酶消化法+自制转子磁力搅拌更优于酶消化法+吸管吹打,可以有效获取心肌细胞,BrdU有利于心肌细胞的纯化。

腺病毒过表达TNNI3K基因对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度的影响

目的检测TNNI3K基因过表达对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度变化的影响,为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供了可靠有效的研究模型。方法恒压Langedoff灌流装置逆向灌流法分离成年大鼠心肌细胞,之后对该心肌细胞进行逐级复钙。然后,将心肌细胞接种于改良的M199培养基中。分别感染Ad.GFP病毒和Ad.TNNI3K病毒,24小时后,以IonOptix单细胞可视化动缘系统检测心肌细胞肌丝钙敏感度。结果成功分离培养了成年大鼠心肌细胞,并在该细胞中成功过表达了TNNI3K基因。钙敏感度测定结果表明,TNNI3K基因能够增强心肌细胞肌丝钙敏感度。结论在本实验成功分离培养的成年大鼠心肌细胞中以腺病毒载体过表达TNNI3K基因,可增强心肌细胞肌丝的钙敏感度,该模型为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能中的作用及机制奠定了基础。