Duplex PCR Detection of Pseudomonas savastanoi pv.phaseolicola and Curtobacterium flaccumfaciens pv,flaccumfaciens in Soybean

The paper aimed to establish a duplex PCR method for simultaneous detection of Pseudomonas savastanoi pv. Phaseolicola (Psp) and Curtobacterium flaccumfaciens pv. Flaccumfaciens (Cff). Based on the argK gene of Psp in GenBank,the primers PSPF1 / PSPR2 were designed. The duplex PCR assay was developed using the combined primers PSPF1 / PSPR2 and CffF1 / CffR2,which were specific primers for Cff. The reaction conditions were optimized and specificity and sensitivity of the duplex PCR were tested. The expected DNA fragment was specifically amplified from the genomic DNA of Psp and Cff. Specificity was confirmed in the artificially inoculated soybean samples imported. Thus,the duplex PCR developed in this study could be used for the simultaneous detection of Psp and Cff from imported soybean.

落葵上发现短小杆菌属(Curtobacterium)一个新的致病变种

1994年在江苏省南京及镇江地区新发现了落葵细菌性叶斑病 ,从病斑所分离的 10个细菌菌株经柯赫氏法则验证 ,均确系该病的病原菌。采用形态观察、表型特征和生理生化特性测定、数值分析、血清学反应、细胞化学成分分析和 DNA G+C mol%测定进行了鉴定 ,并与植物病原棒形细菌 15个标准菌株进行了比较。该病原菌为革兰氏阳性细菌 ,不规则短杆状 ,有一根鞭毛 ,亚极生或侧生 ,结合其生理生化特性、细胞化学成分和 DNA G+C mol%测定结果 ,认为应属于短小杆菌属( Curtobacterium)的萎蔫短小杆菌 ( Cur.flaccumfaciens) ,数值分析也支持这一结论。此外 ,据血清学反应结果及其对短小杆菌属的其它植物寄主的致病情况 ,认为该病原菌应是萎蔫短小杆菌种下一个新的致病变种 ,定名为 Curtobacterium flaccumfaciens pv.basellae pv.nov.(萎蔫短小杆菌落葵致病变种 )。

利用BIOLOG鉴定系统快速鉴定菜豆萎蔫病菌的研究

本研究利用美国Ｂｉｏｌｏｇ公司生产的ＭｉｃｒｏＳｔａｔｉｏｎＴＭＶ３．５系统对我国一类危险性病害菜豆萎蔫病菌及其相关菌进行了快速鉴定研究。研究结果表明，来自不同国家和寄主的２４株菜豆萎蔫病菌及其相关致病变种，２３株准确鉴定至种水平，其中１３株鉴定至致病变种水平，种水平的鉴定准确率为９５．８％，另外１株至属水平。同时２株苜蓿萎蔫病菌和２株番茄溃疡病菌均鉴定至致病变种水平。经聚类分析研究，结果支持了对格兰氏阳性植病细菌在属、种水平的分类。本研究是首次使用该系统对格兰氏阳性植病细菌进行鉴定研究，试验证明Ｂｉｏｌｏｇ鉴定系统用于快速鉴定菜豆萎蔫病菌是一个很有用的工具，且由于其标准化程度高、快速准确。

菜豆萎蔫病菌的PCR检测技术

根据在GenBank已登录的萎蔫短小杆菌 (Curtobacterium flaccumfaciens)的基因间重复序列 ,用DNAman 5 0软件比较同源性 ,设计了一对引物CffF1和CffR2 ,并以菜豆萎蔫病菌的基因组DNA为模板进行扩增 ,得到了一段长 2 80bp的PCR特异产物。参试的其他属如棒形细菌属 (Clavibacter)、节杆菌属 (Arthrobacter)、拉氏杆菌属 (Rathayibac ter)、红球菌属 (Rhodococcus)细菌和萎蔫短小杆菌的其他致病变种 (Cur f pv oortii、Cur f pv poinsettiae、Cur f pv betae) ,以及其他植物病原细菌的基因组DNA均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高 ,在 10

植物病原棒形细菌的RAPD分析

采用RAPD分析技术对萎蔫短小杆菌落葵致病变种(Curtobacterium flaccumfaciens pv.basellae pv.nov.)和萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfaciens pv.beticola pv.nov.)及植物病原棒形细菌4个属的15个菌株进行分类研究:从50条随机引物中筛选出20条,共产生225条带,多态性条带占80.4%。遗传相似矩阵及UPGMA聚类分析,表明这两个新致病变种与萎蔫短小杆菌属亲缘关系近,最小相似系数为0.6511;与其他属细菌亲缘关系较远;结合前人研究结果对植物病原棒形细菌新近提出的分类地位的改变进行了探讨。

菜豆萎蔫病菌的血清检测鉴定技术研究

本研究对我国一类检疫性有害生物菜豆萎蔫病菌（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｃｕｍｆａ－ｃｉｅｎｓｐｖ．ｆｌａｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ，Ｃｆ）进行血清检测鉴定技术的研究。试验中制备了抗Ｃｆ的血清，应用抗００２０，０２３７，０２３８菌株的抗血清及其ＦＩＴＣ标记的抗体进行间接和直接免疫荧光染色试验（ＩＦ／ＩＦ）。通过对１９个Ｃｆ菌株和其它６个属１４个种的植物病原细菌２０个菌株的测定，结果发现约５０％的Ｃｆ菌株为强阳性反应，且与Ｃｆ种下致病变种也有强阳性交叉反应。由于单个血清检测易产生假阴性反应，故将三种血清１∶１∶１混合后进行ＩＦ试验，结果表明与所有的Ｃｆ菌株反应，且与Ｒｆａ和Ｃｍｔ有弱阳性反应。对含１０４～１０７ｃｆｕ／ｍｌ细菌及３０ｇ种子含１粒人工接种种子的种子抽提液均能检测到典型的阳性细胞，血清检测的灵敏度为４．５×１０４ｃｆｕ／ｍｌ，可用于种子的检测。

菜豆萎蔫病菌的种子检验鉴定技术研究

本研究对我国一类检疫性有害生物菜豆萎蔫病菌Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｃｃｕｍｆａ－ｃｉｅｎｓｐｖ．ｆｌａｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ（Ｃｆ）进行种子检测鉴定技术的研究，发现５２３，ＮＢＹ＋ＴＴＣ和ＮＢＹ＋刚果红三种培养基均可作为分离培养基；对带菌种子分离的灵敏度为１．８×１０２ｃｆｕ／ｍｌ，病叶柄和茎是分离的最佳部位，病菌可通过种子传给种苗引起种苗发病，发病时间为７～２０天，针刺接种是Ｃｆ最有效的接种方法，接种发病率为１００％。使用标准化的Ｂｉｏｌｏｇ鉴定系统鉴定病原，在种水平的鉴定准确率达９８．５％。

引起糖甜菜细菌性叶斑病的萎蔫短小杆菌新致病变种

1995年在内蒙古临河市新发现了糖甜菜细菌性叶斑病 ,从病斑所分离的 10个细菌菌株经柯赫氏法则验证 ,均确系该病的病原菌。采用形态观察、表型特征和生理生化特性测定、数值分析、血清学反应、细胞化学成分分析、DNAG +Cmol%和DNA DNA同源性测定进行了鉴定 ,并与植物病原棒形细菌 15个标准菌株进行了比较。该病原菌为革兰氏阳性细菌 ,不规则短杆状 ,有一根鞭毛、亚极生或侧生 ,结合其生理生化特性、细胞化学成分和DNAG +Cmol%和DNA DNA同源性测定结果 ,认为应属于短小杆菌属 (Curtobacterium)的萎蔫短小杆菌 (Cur.flaccumfaciens) ,数值分析也支持这一结论。此外 ,据血清学反应结果及其对短小杆菌属的其它植物寄主的致病情况 ,认为该病原菌应是萎蔫短小杆菌种下的一个新的致病变种 ,定名为Curtobacteriumflaccumfacienspv .beticolapv.nov.Chenetal.,2 0 0 0 (萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种 )

双重PCR法同步检测菜豆晕疫病菌和萎蔫病菌

为建立同步检测菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌的双重PCR方法,根据Gen Bank上公布的菜豆晕疫病菌arg K基因特异性序列设计1对特异性引物PSPF1/PSPR2,将设计的引物与已发表的检测菜豆细菌性萎蔫病菌特异性引物Cff F1/CffR2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。结果显示,采用双重PCR体系,能从菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌基因组DNA以及人工模拟带菌大豆种子样品中扩增到特异性条带,表明本研究所建立的双重PCR检测方法能同时检测出菜豆晕疫病菌和细菌性萎蔫病菌,可用于口岸进口大豆中2种检疫性细菌的检测。

巢式PCR检测菜豆细菌性萎蔫病菌

为了实现对进口大豆样品中菜豆细菌性萎蔫病菌的快速检测,试验根据菜豆细菌性萎蔫病菌的REP-PCR扩增测序结果,设计了1条特异性引物Cff F11,与引物Cff FOR组合,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆细菌性萎蔫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR方法检测菜豆细菌性萎蔫病菌菌悬液时,其灵敏度达到3.1×103cfu·m L-1,比常规PCR灵敏度高1 000倍。制备带菌率为0.5%的大豆样品,用巢式PCR方法 1h内就可进行检测,检测时间大大缩短;在对实验室留存的100份进口大豆样品检测时,1份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明此份大豆样品中携带的病菌为菜豆细菌性萎蔫病菌。本试验所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆细菌性萎蔫病菌的检测。

内蒙古糖甜菜叶斑病菌的多样性分析

采用ERIC-PCR,BOX-PCR和ITS的分析方法,对分离自我国内蒙古自治区5个市的21个糖甜菜叶斑病菌菌株进行多样性分析,并与其他12种病原细菌进行比较。ERIC-PCR揭示,在相似性80%上所有参试菌株分为26簇,而BOX-PCR只得到20个簇,暗示这两种短重复序列在基因组中的分布不同;将两者电泳图谱结合,得到介于上述两者间的结果,分为23个簇;在相似率达87%时,ITS分析将21个糖甜菜叶斑病菌菌株分成7簇。3种分析方法相互验证,均说明内蒙古糖甜菜叶斑病菌基因组存在显著多样性。ERIC和BOX聚类证明了糖甜菜叶斑病菌与短小杆菌属(Curtobacterium)亲缘关系较近,与其他属细菌亲缘关系较远。研究证明,ERIC和BOX扩增基因组DNA指纹比ITS图谱具有更强的多样性。

菜豆细菌性萎蔫病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR检测

将菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacteriumflaccumfacienspv.flaccumfaciens)16SrDNA基因进行克隆测序,并依据此序列设计菜豆细菌性萎蔫病菌的实时荧光PCR引物和特异性探针,对所收集的样品进行了检测.结果表明,该检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等优点,只有菜豆细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他细菌没有荧光产生.检测的灵敏度为105CFU/mL的细菌悬浮液,相对灵敏度为106CFU/mL.

菜豆细菌性萎蔫病菌传入中国的风险分析

从世界分布、主要寄主、经济重要性、传入可能性和风险管理难度5个方面对菜豆细菌性萎蔫病菌传入我国的风险进行评估。结果表明,该病菌是特别危险的有害生物。根据分析结果提出了非疫区输入、输出国应严格检疫、进境口岸加严检查等相应的风险管理措施。

进境澳大利亚绿豆中菜豆细菌性萎蔫病菌的检测

利用NA培养基从澳大利亚进境绿豆样品中分离到一株疑似菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens,Cff)的细菌分离物2000-1,对该分离物进行革兰染色试验、PCR检测、多位点序列分析和致病性测试。分离物在NA平板上菌落浅黄色,圆形,隆起,黏性,有光泽且边缘整齐,革兰染色阳性。特异引物CffFOR2/CffREV4可扩增出306 bp的预期产物。分离物2000-1的16S rRNA序列与Cff菌株ATCC 51876完全一致,与GenBank中Cff菌株P990的序列相似性为99.58%,序列差异为3 nt。基于6个看家基因(atpD、dnaK、gyrB、ppK、recA和rpoB)的系统发育树显示,分离物2000-1与Cff相关种处于同一分支,与其中巴西大麦Cff分离物3185 UNESP亲缘关系最近,而与菌株ATCC 51876处于不同分支。分离物人工接种可引起大豆叶片水渍状病斑,大豆叶片出现萎蔫和焦枯,病斑周围伴有金黄色晕圈。根据以上测试结果,将分离物2000-1鉴定为菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens)。这是全国首次从进境绿豆中截获Cff。