大花蕙兰(Cymbidium hybridium)离体快速繁殖技术

以大花蕙兰茎尖和茎节段作外植体进行了离体快速繁殖技术研究。结果显示:茎尖诱导芽的效果优于茎节段;适宜诱导培养基为MS+BA4.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+AC0.6g·L-1,茎尖在该培养基上芽的诱导率为71.4%;丛芽增殖适宜培养基为MS+BA2.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+AC03.g·L-1,增殖率为3.79;原球茎增殖、分化的适宜培养基为MS+BA1.0mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+AC0.3g·L-1,增殖率为6.1,分化率为71.1%;生根和壮苗的适宜培养基为MS+NAA0.5mg·L-1+AC0.3g·L-1,试管苗生根率达100%。

熵权赋权法灰色系统理论在大花蕙兰(Cymbidium hybridium)品种综合评价中的应用初探

通过运用熵权赋权法灰色系统理论对17个大花蕙兰品种观赏性及适应性进行了综合评价,以期选出适合四川地区栽培的大花蕙兰品种。结果显示,黄金薄荷、浪漫、红颜关联度值较高,均大于0.6,综合性状较好;红玫瑰、红霞、黄奥斯、爱我、苏珊娜、钢琴家、金小姐和艳后关联度值大于0.5,小于0.6,综合性状表现一般;绿洲、爱神、阳春4号、梦境、马州利卡、粉曼娜关联度值小于0.5,综合性状表现不好。其中黄金薄荷和浪漫关联度值基本达到0.7,表明这2个品种适合四川地区栽培。评价结果与生产实际相符,说明熵权赋权法的灰色系统理论可以用于大花蕙兰资源的综合评价。

复合抗氧化剂对大花蕙兰(Cymbidium hybridium)组织培养的影响

研究了3种抗氧化剂(抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸)对3个大花蕙兰品种组织培养的影响。结果表明:在一定浓度下三者配合使用能明显抑制褐变的产生,在含有抗坏血酸0.125 g/L、亚硫酸钠0.125g/L、柠檬酸2.5g/L及BA 4 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L的MS培养基上,3个品种的芽增殖系数分别为8.3、7.1和4.0,与对照相比差异达极显著水平;但高浓度抗氧化剂会对大花蕙兰产生伤害。

植物生长调节剂对3个大花蕙兰(Cymbidium hybridium)品种类原球茎及不定芽诱导的影响

研究了多种植物生长调节剂(Plant growth regulator,PGR)对3个大花蕙兰品种‘金色年华'、‘绿洲'和‘华尔兹'类原球茎(Protocorm-like body,PLB)和不定芽诱导的影响。结果表明:PGR在一定浓度下能促进类原球茎的产生,MS培养基上PLB诱导的最适PGR配比为BA 4 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L+TDZ 0.2 mg/L,增殖系数分别为11.12、9.65和7.54,与对照(BA 4 mg/L+NAA 0.5 mg/L)相比差异达到极显著水平。选取PLB诱导率最低的品种‘华尔兹'建立诱导不定芽的离体再生途径,筛选出不定芽诱导的最佳PGR配比为BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PIC(毒莠定,Picloram)1 mg/L,平均增殖系数为5.08。于MS培养基中添加NAA 0.2 mg/L+HMI(恶霉灵,Hymexazol)2 mg/L,4 d时的生根率高达85%。试验表明:大花蕙兰通过类原球茎和不定芽的诱导均能实现产业化繁殖种苗的目的,前者增殖速度快,后者则再生植株生长势强、驯化移栽易于成活。

墨兰与大花蕙兰种间杂种原球茎的诱导及增殖研究

利用墨兰与大花蕙兰进行种间杂交 ,成功获得了 5个组合的杂种原球茎和植株。墨兰×大花蕙兰及大花蕙兰×墨兰 ,均以原球茎方式萌发。以墨兰×大花蕙兰的杂种原球茎为材料 ,通过L9(34)正交设计研究了NH4NO3 、KH2 PO4、 6 BA和NAA等因素对杂种原球茎增殖的影响 ,发现NAA对原球茎的增殖影响不大 ,NH4NO3 16 5 0mg·L-1(MS正常浓度水平 ) ,提高KH2 PO4浓度 (170～ 85 0mg·L-1)和 6 BA浓度 (1～ 10mg·L-1)有利于原球茎的增殖。 9个培养基中以MS +NH4NO3 16 5 0mg·L-1+KH2 PO4340mg·L-1+6 BA 10mg·L-1效果最好。

大花蕙兰MADS-box基因ChMADS1的克隆及表达分析

根据MADS-box基因保守区结构,设计简并性引物,从大花蕙兰(Cymbidium hybridium)子房中分离和克隆到一个MADS-box基因全序列cDNA(ChMADS1),序列分析表明该基因长871 bp,含一个编码228个氨基酸的完整开放读码框,具有典型的植物MADS-box蛋白结构,由MADS盒、I、K、C区四部分组成.该基因编码的蛋白质与另两种兰花的AP3类MADS盒基因蛋白质PeAP3(89%/94%)和DcOAP3A(89%/95%)同源性较高,属于B组AP3基因家族中的paleoAP3基因.RT-PCR和反Northern杂交分析进一步证实其在子房以及花的各个器官中表达,是B组AP3基因家族中具特殊表达功能的一个新成员.

大花蕙兰子房授粉前后基因组DNA胞嘧啶甲基化状态的MSAP分析

应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术分析了大花蕙兰(Cymbidium hybridium)授粉前后子房DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。采用72对引物进行选择性扩增,共得到5892条带,其中748条带为甲基化多态性带。结果显示DNA甲基化在大花蕙兰子房发育过程中发生频繁,从授粉前后子房的总扩增位点甲基化水平(14%和11.4%)和全甲基化率(9.5%和7.8%)来看,授粉后都略低于未授粉子房,表明子房在授粉后的发育过程中在某些位点发生了去甲基化。除甲基化水平有变化外,大花蕙兰子房授粉前后的DNA甲基化模式也存在较大差异,共检测到14种带型,分为两大类(Ⅰ和Ⅱ型)。其中,授粉前后DNA甲基化状态保持不变的位点较少,只占25.6%,归为Ⅰ型;大部分检测位点(占74.4%,归为Ⅱ型)的DNA甲基化模式在授粉前后存在显著差异。上述结果表明,大花蕙兰子房发育过程中以DNA甲基化为代表的表观遗传调控起重要作用。本研究的开展将促进对与大花蕙兰子房发育相关的甲基化差异片段及受DNA甲基化调控的关键基因的克隆,进而为从表观遗传学这一新角度揭示大花蕙兰子房发育的分子机制奠定基础。

大花蕙兰四倍体的离体诱导和鉴定

采用组织培养方法研究了秋水仙素处理对大花蕙兰类原球茎增殖、分化和四倍体诱导的效应。结果表明,秋水仙素处理明显抑制类原球茎的增殖和分化,提高类原球茎褐变率和死亡率;在试验浓度和时间范围内,秋水仙素浓度越高,处理时间越长,抑制作用越强,解除抑制作用所需的继代次数越多。所有秋水仙素处理均能诱导出四倍体,但不同处理的四倍体诱导率不同,当处理浓度为0.05%、时间为5 d时,四倍体诱导率最高,为23.7%。二倍体及其四倍体的气孔保卫细胞长度和气孔密度均存在极显著的差异。四倍体植株比二倍体矮,茎部较粗壮,株型紧凑,叶片颜色浓绿、质地变硬。秋水仙素处理和组织培养相结合是创建大花蕙兰多倍体的有效方法。

大花蕙兰多倍体的高效诱导

以大花蕙兰‘红瀑布’无菌苗丛芽为材料、秋水仙素为诱变剂,采用不同的处理浓度、时间诱导大花蕙兰体细胞加倍。通过形态学和细胞学观察、统计等方法对其进行倍性鉴定。结果表明:秋水仙素浓度0.05%,处理时间24 h的条件下,诱导率高达28.2%;多倍体苗外部形态、叶绿体数目、气孔数目和大小与二倍体差异大,加倍后的细胞核明显变大,染色体倍数增加。

大花蕙兰高频再生体系的研究

以大花蕙兰无菌苗假球茎为材料诱导丛生芽。适宜诱导的培养基为MS+6.4g·L^(-1)琼脂+0.5%活性炭+2.0mg·L^(-1)6- BA+0.1mg·L^(-1)NAA+30g·L^(-1)蔗糖。其芽长至2～3cm时,转入生根培养基,适宜的生根培养基为MS+6.4g·L^(-1)琼脂+ 0.2mg·L^(-1)6-BA+0.5mg·L^(-1)NAA+0.5mg·L^(-1)生根粉(ABT),生根率为100%。根长2～4cm时炼苗移栽,成活率可达95%。

高光照强度和高CO2浓度对大花蕙兰无菌苗生长的影响

为缩短大花蕙兰无菌苗的生长周期,提高种苗质量,以大花蕙兰无菌苗为材料,采用组培微环境自动控制系统,研究了高光照强度和高CO2浓度对其生长的影响。结果表明:大花蕙兰无菌苗在光照强度为105μmol.m-2.s-1和1 000μmol.mol-1CO2环境条件下培养30 d后与普通培养条件下的无菌苗相比,其干重、根的鲜重、根系活力、可溶性糖含量和叶绿素a/b均有显著增加,分别增加32%、29%、63%、73%和6%;培养50 d后无菌苗净光合速率比普通培养条件下的无菌苗提高了近7倍。表明高光照强度和高CO2浓度可显著增强无菌苗光合自养能力,加快大花蕙兰无菌苗的生长,提高种苗质量。

大花蕙兰基因组DNA提取及RAPD反应条件探索

用SDS、CTAB和改良CTAB法分别提取大花蕙兰叶片基因组DNA,发现以改良CTAB法提取的DNA纯度高,产率也较高。以5’-GGTGCTCCGT-3(’BA440)为随机引物,并以大花蕙兰品‘种金杯(’Cymbidiumhybridiumcv.HiroshimaGoldenCu“pSunnyMoon”)的DNA为模板,对RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)反应体系进行了优化研究,结果表明,25μl反应体系中,Mg2+、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA和dNTP5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:2.0mmol/L、1.0U、0.20μmol/L、25ng和0.20mmol/L。扩增程序优化为:94℃预变性4min;94℃变性0.5min,37℃退火1min,72℃延伸1min,40个循环;最后72℃延伸7min。

4种大花蕙兰与国兰杂交F_1代核型分析

首次报道4种大花蕙兰与国兰杂交后代染色体形态与核型。结果如下:绿宝石×春剑(Cym.LovelyValley‘Evergreen’×Cym.Longibracteatum)后代2n=3x=45m+15sm,核不对称系数为59.75%,2B型;天使×蕙兰(Cym.KLR565×Cym.faberi)后代2n=3x=42m+18sm,核不对称系数为59.33%,2B型;夏绿×春剑(Cym.SummerQueen×Cym.Longibracteatum)后代2n=2x=30m+10sm,核不对称系数为58.58%,2B型;圣蕾芬×春剑(Cym.SaintRaphin×Cym.Longibracteatum)后代2n=2x=34m+6sm,核不对称系数为57.15%,2B型;结合兰属植物若干稳定特化的形态学特征,讨论了兰属植物的核型进化。

大花蕙兰‘黄金小神童’花期研究初探

通过2000～2003年每月对大花蕙兰黄金小神童从新出叶芽到开花进行跟踪调查,初步掌握了黄金小神童不同时期长出的叶芽长成成熟株后的开花规律。调查结果表明:黄金小神童全年均有新的叶芽和花芽长出,新叶芽长出后经过6～10个月的生长发育成为具有6～8片叶的成熟植株,花芽长出后约1个月发育成具有6～9个花蕾的花葶。叶芽从长出到出花芽约需5～11个月,而7～9个月龄的开花率最高。8～9月份长出的叶芽成株后出花率最高,约占全年花芽数的一半,其余各月差异不大。各月出花率不同,4～7月份为出花芽的高峰期,在两年试验中,分别占全年花芽数的72.83%和78.56%;12月份到次年1月长出的花芽最少,分别只占全年花芽数的4.11%和5.03%。其余月份长出的新叶芽的生长情况和出花芽率处于中间类型。通过此试验为黄金小神童的花期调控提供依据,留取可能在预定时期开花的叶芽,控制其他时期的叶芽,达到调节花期的目的。

大花蕙兰组织培养的研究进展及应用

系统论述了大花蕙兰(Cymbidium hybridium)组织培养的概况和发展简史,综述了国内外大花蕙兰组织培养中外植体的选择、培养基的选择、激素配方的选择、培养容器的选择、培养条件、褐变的控制和正确的操作方法等方面的最新研究动向,提出了我国大花蕙兰组织培养中存在的问题以及对我国大花蕙兰快繁技术的展望。

不同EC值营养液对大花蕙兰生长及开花的影响

以大花蕙兰大花品种金门和小花品种红祖为材料,研究了不同EC值营养液对大花蕙兰生长及开花的影响。结果表明:大花品种金门以营养液EC值为1.4～2.8 mS/cm时植株生长发育较好,开花品质最佳,其中EC值为2.1 mS/cm时效果最好,平均单株花箭数为6.15枝,平均花箭长度达到60.28 cm,平均单枝小花数达到13.04朵;小花品种红祖以营养液EC值为0.7～1.4 mS/cm时植株生长发育较好,开花品质最佳,其中EC值为1.4 mS/cm时效果最好,平均单株花箭数为4.32枝,平均花箭长度达到45.91 cm,平均单枝小花数达到17.89朵。

春兰×大花蕙兰杂种试管苗开花现象

以野生春兰(Cymbidiumgoeringii)为母本,大花蕙兰(C.hybridium)为父本进行杂交,由杂交种子获得800多个春兰×大花蕙兰杂种原球茎无性系。其中一个杂种株系的原球茎继代培养2个月后,形成肉眼可见的花蕾。诱导花芽形成的最适激素组合为6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L,总花芽形成率达31%。诱导花芽形成的最适材料为1￣2cm幼苗,花芽形成率达19%。

植物激素对大花蕙兰丛生芽增殖与生长的影响

[目的]研究不同种类、浓度及配比的植物激素对大花蕙兰丛生芽增殖与生长的影响。[方法]以大花蕙兰试管苗为外植体,接种于附加不同种类、浓度及配比植物激素的MS培养基中进行培养。[结果]不同浓度6-BA、KT、ZT与同一浓度NAA(0.2mg·L^(-1))配比时,均可诱导大花蕙兰不定芽分化丛生芽,实现增殖,但增殖倍率和苗的生长情况存在差异,其中以培养基为MS+6-BA 3 mg·L^(-1)+NAA 0.2 mg·L^(-1)时,大花蕙兰丛生芽增殖倍率最高,达3.57倍,且丛生芽生长健壮,叶片浓绿;在附加ZT的培养基中,丛生芽增殖倍率低,最高为2.07倍,且丛生芽生长较慢,不够健壮,但试管苗不易褐化。同一浓度BA(3mg·L^(-1))与不同浓度IBA配比时,以IBA 1.0mg·L^(-1)时丛生芽增殖倍率略低,为2.03倍,但苗生长健壮,可直接成苗。[结论]不同植物激素对大花蕙兰丛生芽增殖和生长的影响不同,其最适宜培养基为MS+6-BA 3mg·L^(-1)+NAA 0.2mg·L^(-1)。

大花蕙兰授粉后子房cDNA差异表达片段序列分析

应用mRNA差异显示(DDRT-PCR)方法比较分析了大花蕙兰(Cymbidiumhybridium)授粉后2d与未授粉子房的基因表达差异。结果分离到了7个在授粉后子房中特异表达的cDNA片段,分别命名为CDD-313,CDD-272,CDD-265,CDD-243,CDD-193,CDD-218,CDD-470。在GenBank中进行同源性比较发现前4个没有同源序列与之匹配;后3个片段推导的氨基酸序列分别与ABC型transporter,GTPase和40S核糖体蛋白质S3(RPS3)有高度同源性。反向Northern杂交进一步证实它们存在,并在授粉子房中高度表达。其中,最为有意义的是CDD-470,其推定的氨基酸与参与细胞生长分化的植物源多功能蛋白RPS3高度同源性,进而推测其与RPS3有相似的功能,可能与兰花子房发育有关,这为解释花发育分子机制提供了新资料。

‘紫岩素’大花蕙兰与墨兰3个品种杂交坐果的研究

为筛选出易栽培种植开花、耐高温且抗性强的大花蕙兰新种质,开展了‘紫岩素’大花蕙兰与墨兰品种‘金咀’、‘企剑白墨’和‘企剑黑墨’的杂交研究。结果表明：正交和反交的坐果率差异较大;以‘紫岩素’为母本、墨兰作父本杂交的坐果率高,授粉后第210天,与‘金咀’、‘企剑白墨’和‘企剑黑墨’的杂交坐果率分别为81.5%、89.8%和78.0%;以墨兰为母本、‘紫岩素’作父本杂交时落果严重,授粉后第210天,‘金咀’、‘企剑白墨’和‘企剑黑墨’的坐果率分别只有0.0%、0.0%和10.3%;‘紫岩素’与墨兰3个品种正交和反交的果荚,其果长及果宽的生长发育曲线均呈“S”型;以‘紫岩素’为母本的各杂交组合果长于授粉后100~210 d达到最大值（≈8.70 cm）,果宽于授粉后180~210 d达到最大值（≈18.65 mm）;以‘紫岩素’为父本的各杂交组合果长于授粉后120~210 d时达到最大值（≈4.20 cm）,果宽于授粉后150~210 d时达到最大值（≈8.60 mm）。