金钱鱼脑型芳香化酶基因cDNA的克隆及表达分析

为了探讨Cyp19a1b基因表达与温度及鱼油添加量的相互关系,奠定金钱鱼人工繁育理论基础,作者采用RT-PCR和RACE法,克隆了金钱鱼（Scatophagus argue Linnaeus）脑型芳香化酶基因（Cyp19a1b）;采用实时荧光定量PCR法,检测了不同温度（23、26和29℃）和不同水平鱼油（0、2%和6%）处理后二龄雌性金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA表达。结果表明：Cyp19a1b cDNA全长2409bp,5′端非编码区164 bp,3′端（不包括poly（A））712 bp,开放阅读框（ORF）1506 bp,编码501个氨基酸,推测其蛋白质分子量为56.697 kDa。序列分析及分子系统进化树结果表明：金钱鱼Cyp19a1b氨基酸序列与黄锡鲷和舌齿鲈Cyp19a1b同源性较高,分别为86.2%、86.5%,与鲤鱼（Cyprinus carpio）、稀有鲫（Gobiocypris rarus）、斑马鱼（Danio rerio）、赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、南方大口鲇（Silurus meridionalis）和鲻鱼（Mugil cephalus）Cyp19a1b同源性为64.1%-84.4%,但与上述7种鱼性腺芳香化酶（Cyp19a1a）同源性低于63.5%,同源性分析结果与根据传统形态学和生化特征分类的结果相一致。荧光定量PCR结果显示,随处理时间的延长,26℃和29℃组金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量都逐渐降低,但29℃组显著低于26℃组（P〈0.05）,而23℃组在6周时则显著高于26℃和29℃组（P〈0.05）,约为26℃组2倍的表达量;鱼油处理3个投喂组脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量均逐渐降低,但鱼油对金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达量无显著影响（P〉0.05）。以上结果表明：随着卵巢发育或鱼油含量的提高,可降低雌性金钱鱼脑垂体中Cyp19a1b mRNA的表达,这种降低可能是E2反馈调节所致;水温高于26℃将抑制Cyp19a1b mRNA的表达。

Cyp19a1基因在中华鳖早期卵巢分化中的功能研究

芳香化酶是雌激素合成的关键酶,在非哺乳类脊椎动物的早期雌性性腺分化中起重要的调控作用.本研究首先分析了中华鳖(Pelodiscus sinensis)芳香化酶编码基因Cyp19a1在不同组织及不同发育时期雌雄胚胎性腺中的表达情况;其次,利用芳香化酶抑制剂(AI)和慢病毒RNA干扰及过表达技术,进行Cyp19a1基因的功能验证研究.研究结果表明,Cyp19a1基因在中华鳖成体卵巢组织中高度特异性表达,睾丸和心、肝、脾、肺、肾、肌、肠中未见表达.同时发现,Cyp19a1基因在第18期就呈现雌性性腺特异性表达,早于性腺分化启动时间(第19期).功能缺失实验表明,经过AI及Cyp19a1-shRNA处理后,ZW胚胎性腺皮质区退化,髓质区高度发育,形成原始性索结构,呈现雌性向雄性性逆转现象;同时雌性标记基因Foxl2的表达量下调,雄性标记基因Amh的表达量则显著上调.功能获得实验则表明,Cyp19a1过表达后的ZZ型性腺皮质区高度发育,髓质区退化,形成空洞结构,呈典型雌性特征,同时Foxl2基因的表达量上升,Amh的表达量显著降低.综上所述,本文证明了Cyp19a1是中华鳖早期卵巢分化的关键调控因子,为中华鳖性别分化机制研究奠定了基础.