CK10、CK14、p63在移植至裸鼠皮下的人表皮的表达

目的研究人表皮移植至裸鼠皮下后表皮细胞的表型变化。方法将制备的人包皮表皮皮片移植到裸鼠背部皮下,7d取材。移植前后人表皮皮片标本行HE染色及细胞角蛋白10(CK10)、细胞角蛋白14(CK14)、p63免疫组织化学染色镜下观察。结果人表皮皮片移植到裸鼠皮下成活率达70%,移植成活的表皮基底层细胞增殖,细胞数增多,新生表皮增厚。免疫组化结果显示,与移植前相比,CK10表达减弱,CK14和p63表达增强,这与人皮肤创伤愈合过程中表皮细胞表型变化一致。结论移植人表皮到裸鼠皮下的方法可以模拟人皮肤创伤愈合过程,是一种可行的在体研究人表皮细胞的实验方法。

细胞角蛋白14和P16在宫颈病变组织中的表达及其诊断价值

目的探讨细胞角蛋白14(CK14)和P16在宫颈病变组织中的表达及其病理诊断价值。方法应用免疫组化En Vision法检测30例正常宫颈、40例宫颈低级别鳞状上皮内病变、40例宫颈高级别鳞状上皮内病变及30例宫颈鳞状细胞癌组织中CK14和P16的表达。结果 CK14在正常宫颈、低级别鳞状上皮内病变、高级别鳞状上皮内病变和宫颈鳞状细胞癌组织中阳性表达率分别为86.7%、67.5%、40.0%、26.7%,前2组的阳性表达率明显高于后2组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。P16在正常宫颈、低级别鳞状上皮内病变、宫颈高级别鳞状上皮内病变和宫颈鳞状细胞癌组织中阳性表达率分别为6.7%、42.5%、65.0%、86.7%,前2组的阳性表达率明显低于后2组,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论随着宫颈疾病的进展,CK14表达升高,而P16表达降低,两者联合检测可为宫颈癌前病变的分级和宫颈癌早期诊断提供客观依据。

MEBT/MEBO对慢性难愈合创面组织中CK14及CK19表达水平的影响

目的探讨皮肤再生医疗技术(moist exposed burn therapy/moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)对大鼠慢性难愈合创面组织中CK14及CK19表达水平的影响。方法按照随机数表法将90只SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组,每组18只,空白组大鼠仅做背部备皮处理,急创组大鼠建立急性创面模型,慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠建立慢性创面模型;造模成功后,空白组大鼠备皮处皮肤以及急创组与慢创组大鼠创面予以生理盐水纱布湿敷,rb-bFGF组大鼠创面予以重组牛碱性成纤维细胞生长因子(recombinant bovine basic fibroblast growth factor,rb-bFGF)凝胶治疗,MEBO组大鼠创面予以湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment,MEBO)治疗。分别于局部处理第3、7、14天取各组大鼠皮肤或创面组织行Masson染色,观察组织形态学差异,并进行Western blotting及RT-PCR检测,对比CK14、CK19蛋白表达及其mRNA转录水平。结果(1)Masson染色结果显示,急创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织形态学差异不明显,均可见炎性细胞逐渐减少,新生血管及皮肤附属器逐渐形成,创面组织形态逐渐接近正常,而慢创组大鼠创面组织中炎性细胞消散及新生血管生长较慢,逐渐形成瘢痕组织形态。(2)局部处理第3、7、14天,急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中CK14蛋白表达及其mRNA转录水平均呈逐渐升高的趋势(P均<0.05),至局部处理第14天,急创组、rb-bFGF组及MEBO组均升高至空白组水平(P均>0.05),而慢创组仍低于其它各组(P均<0.05)。(3)局部处理第3、7、14天,急创组、慢创组、rb-bFGF组及MEBO组大鼠创面组织中CK19蛋白表达及其mRNA转录水平均呈先升高后降低的趋势(P均<0.05),至局部处理第14天,急创组、rb-bFGF组及MEBO组均降低至空白组水平(P均>0.05),而慢创组仍高于其它各组(P均<0.05)。结论MEBT/MEBO能够促进慢性难愈合创面愈合,调控创面组织中CK14及CK19的表达水平可能是其部分作用机制。

细胞角蛋白14在牙齿软组织萌出通道中的组织学定位

目的牙齿萌出时,源于成釉器的缩余釉上皮与口腔上皮细胞融合为上皮团形成牙齿的软组织萌出通道,本研究对细胞角蛋白14在这一过程中的表达进行组织学定位,从而探讨其可能作用。方法不同发育期SPF级BALB/c小鼠9只。循环内固定后分别双侧下颌骨10%EDTA脱钙30d,常规脱水包埋,近远中向5μm连续切片,行苏木精-伊红和免疫组化染色。PV免疫组化两步法检测细胞角蛋白14和细胞增殖核抗原在各组织的表达。结果牙齿萌出过程中口腔上皮对细胞角蛋白14呈现时空特异性表达,非牙齿萌出部位的口腔上皮仅基底层阳性表达细胞角蛋白14,而萌出牙齿冠方的口腔上皮阳性表达则较广泛;缩余釉上皮在牙齿萌出过程中始终阳性表达细胞角蛋白14,而且伴随缩余釉上皮和口腔上皮融合的发生,缩余釉上皮的外层细胞和口腔上皮的基底层和基底上层细胞呈现细胞角蛋白14强阳性表达。结论细胞角蛋白14与牙齿萌出软组织通道的形成密切相关,可作为缩余釉上皮相关研究的上皮性标记物。

Vps4b基因敲除鼠上皮根鞘中细胞角蛋白14和增殖细胞核抗原的表达

目的研究Vps4b基因突变对上皮根鞘(HERS)中细胞角蛋白14(CK14)和增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法取出生后(P)5、9、11、15、19d的小鼠的双侧下颌组织,石蜡包埋后获得下颌第一磨牙组织切片,通过免疫组织化学方法比较CK14和PCNA在正常小鼠与Vps4b基因敲除小鼠HERS中的表达情况。结果正常小鼠P5d开始形成HERS,PCNA在HERS细胞中强阳性表达;P9d,HERS结构连续,PCNA在HERS细胞中阳性表达;P11d,一小部分HERS开始断裂,PCNA在HERS细胞中弱阳性表达;P15d,HERS继续断裂,PCNA在牙根表面HERS细胞中弱阳性表达;P19d,牙根达到生理长度,PCNA仅在牙根末端HERS细胞中阳性表达。基因敲除小鼠与正常小鼠相比,P5d同样形成HERS结构,然而其断裂在P9d就开始出现,P19d牙根表面仅存少量HERS碎片,根尖发育不成熟,PCNA表达强度下降。结论Vps4b基因突变可能通过改变HERS中CK14和PCNA的表达,从而导致牙根发育异常。

K14阳性细胞在下颌下腺损伤修复中的分布特征

目的:角蛋白14(cytokeratin 14,K14)是唾液腺干/祖细胞的标志物,本研究探讨K14+细胞在下颌下腺损伤修复中表达分布的特征。方法:构建8周龄小鼠双侧下颌下腺主导管结扎-开放模型,分别于结扎后0、14 d及开放后3、28、56 d收样,利用组织学染色法评估下颌下腺损伤及再生状况,免疫荧光染色法观察K14^(+)细胞增殖,实时荧光定量PCR检测唾液腺功能相关基因表达的变化。结果:在下颌下腺发育过程中K14^(+)细胞随着年龄增长逐渐减少;成功构建小鼠下颌下腺主导管结扎-开放模型,导管结扎后,腺体萎缩,导管扩张;开放导管后,腺体修复早期K14+细胞数目增多,增殖活跃,但是唾液腺功能相关基因表达较低。结论:在下颌下腺损伤修复早期K14^(+)细胞表达增加,提示K14^(+)细胞参与了下颌下腺损伤修复的过程。

人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

背景:皮肤真皮组织是皮肤损伤修复时除表皮基底层以外可形成表皮层结构的重要干细胞来源。目的:探索从人皮肤真皮组织中分离培养角朊干细胞样细胞的新方法。方法:将一定大小的成人腹部全层皮肤组织用Dispase过夜消化后去除表皮层结构,然后用0.1%Ⅰ型胶原酶过夜消化,离心分离以获取真皮来源总细胞。将分离的细胞用含有体积分数1%N2,2%B27,20μg/L表皮生长因子和40μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12(1:1)无血清培养液悬浮后以低密度接种于培养皿进行培养。采用RT-PCR和免疫细胞荧光染色法对其进行分析。结果与结论:RT-PCR分析结果显示所分离的真皮细胞中含有表达Lgr5和Lirg1等特异基因的毛囊来源干细胞;免疫细胞荧光分析结果显示其表达细胞角蛋白8和细胞角蛋白14。在无血清条件下培养6d时,可观察到表达细胞角蛋白14和整合素α6的"铺路石"样细胞克隆。进行传代培养后P1细胞表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63。传代培养至P3,4时大部分细胞分化,不能继续传代。结果证实,以无血清培养液结合低密度培养法可直接从人真皮组织中有效地培养增殖活跃、细胞角蛋白14和P63阳性的角朊干细胞样细胞。

SD大鼠角朊细胞分离培养及鉴定

目的探讨SD大鼠角朊细胞的分离培养技术并鉴定,观察细胞生长情况。方法采用中性蛋白酶(DispaseⅡ)和胰蛋白酶分离角朊细胞,加入含有10%胎牛血清的角质化细胞专用培养基(keratinocyte serum free,K-SFM)培养。用免疫组化法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法进行鉴定。结果角朊细胞生长缓慢,原代培养第5天开始出现细胞克隆,核大而圆,培养11天连成片,培养24天长满单层,细胞传代培养比较困难,很难贴壁,经摸索在培养第15天,细胞长满80%左右时即可传代,但一般传3代后就不能再传。大鼠角朊细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)染色,细胞质呈棕褐色,提示培养的细胞CK19阳性。大鼠角朊细胞标志RT-PCR检测整合素β1、CK14(cytokeratin 14)、CK10(cytokeratin 10)的mRNA表达均阳性。结论用两种酶分离获得的大鼠角朊细胞活性好,降低成纤维细胞污染,用K-SFM培养基培养的细胞经鉴定具有角朊细胞特性,为皮肤组织工程的研究提供良好的种子细胞方面的实验数据。

改良组织块法原代培养大鼠成釉器细胞及其鉴定

目的建立改良组织块法体外培养成釉器细胞的方法,为成釉器细胞的体外培养提供新的实验方法。方法剥离出生4d的SD大鼠下颌磨牙牙胚,胶原酶消化1h,胰酶再消化5min,种植组织块于培养皿中。细胞长出组织块后,细胞刮刮除成纤维样细胞,继续培养,观察形态并应用免疫细胞化学法及RT-PCR法鉴定细胞。结果种植48h后即有细胞长出组织块,细胞主要为铺路石样的、边界整齐的上皮样细胞和梭形的成纤维样细胞。细胞刮刮除成纤维样细胞后,残留上皮样细胞和少量梭形细胞。角蛋白14免疫细胞化学检测显示,上皮样细胞染色阳性,梭形细胞染色阴性。RT-PCR结果显示,所培养的铺路石样上皮细胞釉原蛋白、成釉蛋白mRNA均有特异性表达。结论酶消化组织块法可用于成釉器细胞体外培养,为成釉器细胞的体外培养提供了新的实验方法。

细胞角蛋白14基因在非小细胞肺癌中的表达与意义

目的探讨细胞角蛋白14(CK14)基因的表达在非小细胞肺癌(NSCLC)发生、发展及转移中的意义。方法采用免疫组织化学染色法检测110例NSCLC患者癌组织、癌旁组织、正常肺组织中CK14的表达。采用Western blotting法检测12例患者新鲜组织中CK14的表达。应用非条件Logistic回归分析CK14表达水平与NSCLC患者各临床病理参数的关系。结果免疫组织化学染色结果显示,CK14在NSCLC癌组织中高表达,阳性表达率为68.18%,与癌旁组织和正常肺组织相比,差异有统计学意义(P<0.001)。CK14表达水平与NSCLC患者性别、组织类型、分化程度、分期以及淋巴结转移情况显著相关(P<0.05),与年龄无关(P>0.05)。Western blotting结果显示,CK14在NSCLC癌组织中的表达率较癌旁组织和正常肺组织高。非条件Logistic分析显示,低分化癌、病理分期Ⅱ期和Ⅲ期、CK14表达阳性是NSCLC患者发生淋巴结转移的重要危险因素(P<0.05)。结论 CK14表达在NSCLC的发生、发展和转移中发挥重要作用。CK14有望成为评估NSCLC生物学行为的重要指标。