GM-CSF分泌型肝癌疫苗对荷瘤鼠脾血细胞毒性T淋巴细胞杀伤活性的影响

目的观察粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分泌型肝癌疫苗对移植性肝癌小鼠细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性的影响。方法取小鼠肝癌细胞株H22细胞1×106/只注入小鼠腹腔内,接种7d形成腹水瘤后再在小鼠体内传3代。取生长旺盛且无血性的腹水,在无菌条件下制成2×107/ml的细胞悬液,以2×106细胞/0.1ml/只接种于小鼠右前肢皮下。将肝癌细胞移植瘤动物分成3组。4天后,在右侧背部皮下进行免疫治疗,即制备GM-CSF分泌型H22肝癌瘤苗并免疫ICR小鼠(H22-GM-CSF组,n=5),同时设立无GM-CSF基因修饰H22肝癌瘤苗组(H22组,n=5)和PBs对照组(PBS组,n=5),测量各组小鼠肿瘤体积;采用细胞增殖计数法检测小鼠脾血CTL杀伤活性。结果随着效/靶比增加,各组CTL杀伤活性均增强。在效/靶比为50∶1时,GM-CSF-H22组CTL杀伤活性为60±6.1%,明显高于H22组(17.4±0.9%)和PBS组(12.2±0.6%,P<0.01);GM-CSF分泌型肝癌细胞瘤苗明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长。在21天时,H22-GM-CSF组、H22组和PBS组小鼠肿瘤体积分别为0.63±0.05mm3、1.47±0.75mm3和1.79±0.34mm(3P<0.01)。结论 GM-CSF分泌型肝癌细胞瘤苗可抑制肿瘤细胞生长,增强CTL杀伤活性。

γδT细胞对膀胱癌细胞的细胞毒活性及MICA/B蛋白在膀胱癌中的表达

目的:初步探索γδT细胞在抗膀胱癌过程中的作用及其识别的应激蛋白MICA/B在膀胱癌中的表达情况。方法:经帕米磷酸二钠体外扩增培养膀胱癌患者外周血来源的γδT细胞,利用流式细胞术检测γδT细胞的纯度、扩增效率和经佛波酯/离子霉素(PMA/ionomycin)刺激后CD107a的表达,通过细胞毒实验检测其对膀胱癌细胞株的细胞毒作用;采用流式细胞术和免疫组织化学染色法分别检测膀胱癌细胞株表面和膀胱癌组织中MICA/B蛋白的表达情况。结果:成功扩增6例膀胱癌患者外周血γδT细胞,纯度达75%~94%,γδT细胞绝对数达到初始的109~371倍。经PMA/ionomycin刺激后,表达CD107a的γδT细胞比例明显增加,可达40%~82%,膀胱癌患者的γδT细胞对3株膀胱癌细胞株都有显著的细胞毒作用,且随效靶比增高而增强。3株膀胱癌细胞株表面和26例膀胱癌组织中均不同程度地表达MICA/B,浸润性膀胱癌中MICA/B的染色评分略高于非浸润性膀胱癌,高级别膀胱癌中MICA/B的染色评分要高于低级别膀胱癌,但统计学分析显示组织中MICA/B的染色评分与肿瘤分期、分级没有显著相关性。结论:膀胱癌患者外周血γδT细胞可在体外成功扩增,并显示出显著的抗膀胱癌作用,膀胱癌细胞和组织中都不同程度表达MICA/B,但统计学分析显示MICA/B在膀胱癌组织中的染色评分与肿瘤分期、分级没有相关性。

子宫颈癌的免疫治疗

近几年有研究以免疫治疗运用于子宫颈恶性肿瘤并取得一定的成效,其中包括检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors)、基于树突状细胞的治疗(dendritic cell-based therapy)、免疫T细胞移植(adoptive T-cell transfer)、肿瘤浸润淋巴细胞免疫细胞移植(tumor infiltrating lymphocytesadoptive cell transfer)、基于细胞毒性T淋巴细胞的免疫疗法(cytotoxic T lymphocytes-based immunotherapy)、使用DC-CIK治疗因子诱导的杀伤细胞的免疫疗法(cytokine-induced killer cell-based immunotherapy)、基于DNA的免疫疗法(DNAbased immunotherapy)。免疫治疗的方法包括结合不同免疫治疗方法,或与放化疗结合使用。这些方法为子宫颈癌的治疗提供了新的希望。然而,免疫治疗的机制和制备过程复杂,且个体化治疗要求高,制备效率低、价格昂贵、周期长等问题亟待解决,需要进一步研究和临床共同努力。

hAFP(137-145)肽段修饰树突细胞诱导细胞毒性T淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤效应

目的:通过体外杀伤试验,研究人肝癌特异性甲胎蛋白hAFP(137-145)短肽段修饰树突细胞(DC)后诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对人肝癌细胞的特异杀伤效应,并与完整hAFP蛋白的杀伤效应相比较。方法:选取健康人外周血单个核细胞,体外诱导成熟DC;构建hAFP表达载体,在BL21细菌中异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导原核表达后纯化,与合成的hAFP(137-145)短肽段分别修饰诱导DC细胞,体外刺激细胞毒性T细胞(CTL),通过流式细胞仪法和细胞毒性检测试剂盒法检测修饰后的DC所诱导的CTL在体外对肝癌细胞株的杀伤作用;构建荷瘤裸鼠人HepG2肝癌模型,检测该肽段修饰DC后诱导的CTL细胞在裸鼠过继体内实验中对人肝癌转移瘤的杀伤作用。结果:成功构建了pET-hAFP表达载体,原核表达并纯化后用Western blot检测到hAFP蛋白的表达;hAFP蛋白和hAFP(137-145)短肽段均能在体外修饰和诱导DC细胞的增殖和成熟;hAFP蛋白和hAFP(137-145)短肽段修饰DC体外均能诱导特异性CTL,并通过体外实验验证了其对于肝癌细胞的杀伤效应,其中hAFP(137-145)短肽段诱导CTL的能力和所诱导CTL对于肝癌细胞的杀伤能力相对全长hAFP蛋白较强;动物实验证实,该hAFP(137-145)肽段修饰DC后诱导的CTL细胞在荷瘤裸鼠过继体内实验中对人肝癌转移瘤有明显的杀伤作用,杀伤效率优于完整hAFP蛋白。结论:hAFP蛋白和hAFP(137-145)短肽段修饰DC均具有单独体外诱导特异性CTL的作用,体外实验和动物实验均证实此CTL有特异地杀伤HegG2肝癌细胞的作用;hAFP(137-145)短肽段诱导CTL效率和杀伤肿瘤细胞效率均优于完整hAFP蛋白。

六君子汤对食管癌EC-9706细胞株树突状细胞成熟的影响

目的观察六君子汤对食管癌微环境中树突状细胞的影响及可能作用机制。方法用Fieoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,体外诱导培养树突状细胞,分为正常培养基组(正常培养)、肿瘤培养基组(30%食管癌EC-9706细胞株培养上清)、六君子汤组(30%六君汤干预食管癌EC-9706细胞株培养上清)。7天后采用流式细胞术检测3组树突状细胞表面标志物CD80、CD86、CD1a;MTT法检测淋巴细胞增殖情况,计算刺激指数;LDH释放法检测细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤力,计算特异杀伤率;ELISA法检测白细胞介素12(IL-12)含量,Wester blot法检测STAT3及p-STAT3蛋白表达。结果与正常培养基组比较,肿瘤培养基组树突状细胞表型CD80、CD86、CD1a降低,刺激指数及CTL的特异杀伤率降低,IL-12含量减少,STAT3和p-STAT3蛋白表达升高(P<0.05)。而六君子汤组较肿瘤培养基组树突状细胞CD80、CD86、CD1a增加,刺激指数及CTL特异杀伤率升高,IL-12分泌增加,STAT3和p-STAT3蛋白减少(P<0.05)。结论六君子汤可通过影响食管癌细胞的微环境而使树突状细胞的成熟和免疫活性发生改变,其机制可能与调节STAT3信号通路有关。