DAB_(389)(Gly_4Ser)_2-αMSH重组蛋白的构建表达及特异性细胞毒性研究

目的:构建重组毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,探讨其对过度表达αMSH受体的几种癌细胞的特异杀伤作用。方法:利用含有His.Tag和白喉毒素的基因序列作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2的互补序列基因作下游引物,以pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-EGF为模板,PCR扩增得到DAB389(Gly4Ser)2-αMSH片段,插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH。用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白,用结晶紫法检测重组蛋白对几种癌细胞和正常细胞的毒性作用。结果:构建了含有His.Tag重组表达质粒pET28a-DAB389(Gly4Ser)2-αMSH;SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45.32×103,其表达量占菌体蛋白总量的29.2%;Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合;细胞活性检测表明重组蛋白对SP2/0,HeLa,A549,A375这4种癌细胞有明显的杀伤作用,4种癌细胞的IC50值分别是3.138,2.736,7.243和4.672μg.mL-1。结论:成功构建了具有生物学活性的重组蛋白DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,为进一步的靶向性药物研究奠定了基础。

DAB_(389)(Gly_4Ser)_2-αMSH的纯化及细胞特异性毒性

重组表达载体pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-αMSH在BL21(DE3)中以可溶形式表达重组蛋白,依次通过硫酸铵盐析、离子交换层析、亲和层析纯化、脱盐得93.26%重组蛋白纯品;细胞活性测试结果表明,该重组毒素只对SP2/0、HeLa、A549、A375等4种癌细胞有杀伤作用,对DK、BHK正常细胞没有杀伤力;重组蛋白对SP2/0、HeLa、A549、A375细胞的IC50分别为:3.138、2.736、7.243、4.672 mg/L。

DAB_(389)(Gly_4Ser)_2αMSH重组融合蛋白的构建及表达

利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2互补序列的基因作下游引物,以pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EFG为模板,PCR扩增DAB389(Gly4Ser)2αMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR和Nco酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389(Gly4Ser)2αMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389(Gly4Ser)2αMSH,转化菌经IPTG、30℃诱导5h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果表明扩增的片段与理论值一致。重组质粒的DNA序列分析正确。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为45870,且表达量达菌体总蛋白量的29.2%。Western blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗白喉抗体结合。成功构建表达了重组DAB389(Gly4Ser)2αMSH的工程菌株,表达产物具有生物学活性。

亲和标记DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白的构建、表达及纯化

目的:构建含有亲和标记His-tag的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白,便于融合蛋白质的纯化。方法:利用含有His-tag序列、Factor Xa酶切识别序列、白喉毒素N端序列的基因作上游引物,含有αMSH全序列和(Gly4Ser)2互补序列基因作下游引物,以pET28a/DAB389(Gly4Ser)2EGF为模板,PCR扩增目的基因片段,并插入到原核表达载体pET28a中,构建了重组表达载体pET28a/亲和标记DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,融合蛋白在BL21(λDE3)中以可溶形式表达,通过硫酸铵盐析、亲和层析纯化、脱盐、Factor Xa酶切得到重组蛋白纯品。结果:扩增的片段与理论值一致,序列分析正确;目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的30.6%;纯化得到纯度为94.36%的重组蛋白。结论:成功构建了含有His-tag的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH重组蛋白,减少了纯化步骤,为进一步研究重组毒素、简便纯化途径奠定基础。

两种重组融合蛋白的分子生物学特性比较

使用DNASTAR软件,利用计算机模拟比较了带有亲和标记和连接肽的DAB389（Gly4Ser）2-αMSH与DAB389-αMSH两种融合蛋白的抗原性、亲水性、等电点及表位等分子生物学特性.结果显示,DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的抗原性和表位明显低于DAB389-αMSH,而DAB389（Gly4Ser）2-αMSH的亲水性高于DAB389-αMSH,两者的等电点均为5.9.

细菌一种“新的分泌机制”初探

构建了免疫毒素DAB389(Gly4Ser)2-αMSH的两种表达质粒,其一为胞内表达质粒pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-αMSH,其二为胞周质表达质粒pET20b/DAB389(Gly4Ser)2-αMSH。实验结果显示,置于胞内表达质粒的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH在大肠杆菌的周质腔内分泌表达,而置于胞周质表达质粒的DAB389(Gly4Ser)2-αMSH却不能表达。通过分析免疫毒素的特性,发现DAB389(Gly4Ser)2-αMSH中并不存在信号肽序列;与革兰氏阴性细菌中已发现的四种蛋白质分泌途径特性相比较,发现它不属于其中的任何一种,可能为一种新型细菌分泌机制。