NR/DAPI共染色-荧光计数法测定自来水中的微塑料

为解决现有NR/DAPI共染色-荧光计数法对水样中微塑料(MPs)的高估问题,对水样及实验器具的处理方法进行了优化研究。优化试验结果表明,在500℃条件下对玻璃器皿、滤膜灼烧1 h,可显著减少由实验器具带入样品中的MPs;对自来水样品采用30%H_(2)O_(2)在V_(H_(2)O_(2))∶VH_(2)O=1∶5条件下消解24 h,可消除水样中有机物引起的结果高估。采用改进的NR/DAPI共染色-荧光计数法对合肥市不同区域自来水样品测定结果表明,样品中MPs的平均浓度范围为350~1250个/L,占比最大的MPs种类为聚乙烯(PE,占比为40%~60%),尺寸小于10μm的MPs占比较高(36%~71%)。自来水样品中的MPs具有显著的时间分布特征,在夜间用水低谷时段供水管网中自来水流速低,小颗粒MPs发生沉降聚集,导致早晨龙头初放水中MPs浓度显著高于其他时段。

紫斑牡丹花粉对D-半乳糖致衰老模型小鼠的影响

目的探究紫斑牡丹花粉对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆力及氧化应激损伤的影响。方法60只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、阳性组、紫斑牡丹花粉组(750、1500、3000 mg·kg^(-1)),采用颈背部皮下注射D-半乳糖(500 mg·kg^(-1)),制备亚急性衰老模型。Morris水迷宫评估小鼠学习记忆力;HE、DAPI染色评估肝、脑组织细胞损伤情况;ELISA法检测小鼠血清、肝脑组织内MDA、T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT及γ-H2AX、SA-β-Gal水平。结果水迷宫实验结果表明,紫斑牡丹花粉能明显提高衰老小鼠的学习记忆力。组织染色结果表明,紫斑牡丹花粉对D-半乳糖致衰老小鼠肝脑组织细胞损伤具有保护作用,且高剂量组作用最为明显。ELISA结果显示,与模型组比较,紫斑牡丹花粉各剂量组的MDA、γ-H2AX、SA-β-Gal水平降低,T-AOC、GSH-Px、SOD、CAT水平升高。结论紫斑牡丹花粉能改善D-半乳糖致衰老模型小鼠的学习记忆力,提高衰老小鼠体内抗氧化酶活性和清除自由基、脂质过氧化物的能力,保护肝脑脏器组织细胞免受氧化损伤,提示其具有潜在的延缓衰老的作用。

MTG-DAPI双染色法观察黄瓜花粉细胞半薄切片中线粒体DNA的研究

[目的]MTG(Mito Tracker Green)是一种线粒体特异绿色荧光探针,但是目前还没有研究将MTG应用于细胞的树脂半薄切片中线粒体的荧光染色。分子生物学研究证明黄瓜线粒体是父系遗传但是还没有在细胞学观察中得到进一步证实,因此我们选择MTG和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)2种染料建立适用于黄瓜花粉细胞的树脂半薄切片荧光双染色技术。[方法]树脂半薄切片厚度为0.3μm,切片首先经20 nmol·L-1的MTG染色液处理30 min,然后用0.1μg·m L-1的DAPI溶液染色6 min,即可在荧光显微镜下清楚地显示出线粒体结构及DNA的存在情况。[结果]观察显示:黄瓜贴壁期花粉细胞中生殖细胞内存在线粒体结构及线粒体DNA,表明黄瓜小孢子第一次有丝分裂时没有将线粒体排除在生殖细胞之外,而是被分配到了生殖细胞中,并且此时的线粒体细胞器携带有基因信息。[结论]MTG-DAPI双染色技术可以有效地对黄瓜花粉细胞中生殖细胞核周围的线粒体进行定位,为探索黄瓜线粒体基因父系遗传现象提供技术支持。同时研究也证实了MTG可以对固定后并进行树脂半薄切片的细胞中的线粒体进行着色,扩展了MTG的应用范围。

DAPI染色直接定量测定细菌胞内多聚磷酸盐

采用DAPI将细菌胞内或活性污泥中多聚磷酸盐(Polyp)染色,用酶标仪测定DAPI-Polyp复合物发射荧光的强度,以此定量细菌胞内的Polyp。用该方法和镜检法同时测定异染粒含量差异显著的菌株胞内Polyp,2种方法测定结果一致。异染粒含量差异不显著的菌株胞内Polyp定量分析表明,该方法灵敏度高于镜检法和废水总磷间接测定法。

大肠杆菌O157:H7体内多聚磷酸盐的DAPI荧光定量检测

目的应用荧光剂DAPI探索一种直接定量大肠杆菌O157:H7无机多聚磷酸盐(polyP)的可靠方法。方法提取并纯化大肠杆菌O157:H7野生株DNA,DAPI与DNA、polyP45结合,测定360 nm和415 nm激发光的发射光谱;应用共聚焦显微镜,观察细菌DAPI-DNA和DAPI-polyP复合物荧光,验证DAPI检测polyP的可行性;细菌液氮速冻溶解、-80℃速冻溶解、-20℃速冻溶解、60℃加热10 min、Triton x-100作用、室温下放置后倍比稀释涂平板,观察6种方法对细菌存活的影响;与DAPI作用后,测定荧光值,确定细胞膜通透性的最佳前处理方法;建立标准曲线,测定EHEC野生株、ppk1两个突变株polyP含量。结果应用360 nm激发波长,DAPI-DNA最大发射波长为460 nm;应用415 nm激发波长,DAPI-polyP最大发射波长为550 nm;应用405 nm激发光,收集DAPI-DNA蓝色荧光(425～475 nm),应用488 nm激发光,收集DAPI-polyP绿色荧光(500～560 nm);最佳细菌前处理方法为-80℃速冻后室温下自然溶解;标准曲线为Y=1849X+127.5(R2=0.991),测定各株菌polyP量,其中野生株显著高于ppk1缺失突变株。结论 DAPI荧光定量检测方法具有直接、可靠、易于操作、定量检测等特点,可为进一步研究polyP在肠出血型大肠埃希菌O157:H7中的作用提供技术支持。

一株异养硝化-好氧反硝化-积累磷的细菌Klebsiella pneumoniae A15的筛出及其特性研究

利用以淀粉为唯一碳源的缺氧/好氧序批式系统从污水处理厂活性污泥中分离得到一株肺炎克雷伯氏杆菌A15(Klebsiella pneumoniae A15),该菌具有异养硝化-好氧反硝化和积聚磷能力.它的最佳生长条件:碳源为柠檬酸钠,C/N为30,P/N为0.2,pH为7.在最佳条件下,氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐的最高去除率分别为96.27%、99.22%和100%;相应的去除速率分别为1.77、2.08和1.86mg/(L⋅h).该菌株对浓度为8mg/L的磷酸盐和1300mg/L的COD最高去除率分别为100%和95%.氮平衡分析发现该菌可以利用氨氮、硝氮以及亚硝氮产生气态氮,表现出优异的异养硝化和好氧反硝化活性.对菌株胞内磷和EPS中磷的分析结合DAPI染色发现有82%的磷储存在菌株细胞内并且以多聚磷酸盐形式储存,其余磷在EPS中.对该菌株的napA、nirS、nosZ和ppk基因的成功扩增也表明其好氧反硝化和积聚磷能力.本研究展示了一株在脱氮除磷系统中具有特定功能的细菌.

高质量花生根尖细胞染色体制片方法研究

为了能快速获得用于染色体分带或者荧光原位杂交的高质量花生根尖细胞染色体制片,通过选择适当粗细的花生侧根,经过对二氯苯浸泡预处理,卡诺氏固定液固定后,直接用45%醋酸烘烤压片,得到了细胞平整、染色体分散的根尖细胞染色体制片。与HCl解离压片的方法相比,该方法中试剂对染色体影响微小。与酶解去壁低渗法相比,该方法没有酶解去壁低渗的过程,不需要用果胶酶和纤维素酶等较贵重试剂,节约了时间和成本,提高了制片效率。该方法不仅适用于花生,也适用于芝麻、水稻、玉米、大豆、青豆、番茄等多种植物。

奶牛舍环境中气载微生物含量的检测

【目的】准确地定量奶牛舍环境中气载微生物（细菌和真菌）的含量,并评估其健康风险。【方法】利用国际标准的AGI-30空气采样器,以无菌生理盐水为采样介质,收集奶牛舍空气样品,分别用培养计数法和4,6-联脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色法,对奶牛舍环境中气载微生物含量进行计数,比较两种方法的差异,并对气载微生物潜在危害进行评估。【结果】培养计数法测得奶牛舍内气载微生物含量为1.14×105～8.32×106CFU/m3,而DAPI染色法为9.3×105～5.93×107CFU/m3,DAPI染色法所测气载微生物含量约是培养计数法的7～733倍。以染色法测得的奶牛舍内气载微生物含量计算,人与奶牛每min吸入的微生物量分别为1.58×105CFU和3.29×106CFU。【结论】染色计数法更能客观地反映环境中的气载微生物含量,有助于对环境的健康风险进行科学评估。

大白菜游离小孢子培养胚胎发生中的加倍机制

利用Leica体视显微镜,DAPI荧光染色观察比较大白菜小孢子正常发育为成熟花粉粒与游离小孢子培养胚胎发生细胞核的分裂方式,探讨大白菜游离小孢子培养胚胎发生及其自然加倍的机理。观察结果显示以B途径为主要发育途径的大白菜小孢子,胚胎发生的启动机制是热激诱导下单倍体小孢子体积膨大,染色体发生自然加倍,从而激发小孢子进入孢子体发育途径;大白菜小孢子胚再生植株具有较高的自然加倍率,这与小孢子培养热激诱导激发小孢子单核自然加倍为二倍体密切相关。

培养法和染色法对养殖环境中微生物气溶胶浓度的检测

比较不同检测方法对微生物气溶胶检验效果的影响。采用国际标准的AGI-30空气采样器,收集空气样品,分别用培养计数法和DAPI(4,6-联脒-2-苯基吲哚)染色计数法来比较不同养殖环境中微生物气溶胶的浓度。培养计数法测得鸡舍、猪舍和牛舍环境中微生物气溶胶的浓度分别为5.73×105～6.72×106cfu/m3空气,9.5×105～4.01×106cfu/m3空气,5.4×104～8.33×105cfu/m3空气,而DAPI染色计数的浓度分别为8.0×106～3.25×108cell/m3空气,1.5×107～2.28×108cell/m3空气,9.0×105～5.93×107cell/m3空气。培养计数法所得浓度仅为DAPI染色计数法的0.04%～10.4%。染色计数法可能会更加客观的反映环境中微生物气溶胶的浓度。

番茄的CPD带型和45S rDNA位点的鉴别(英文)

采用CPD(PI和DAPI组合)染色对番茄减数分裂粗线期和有丝分裂中期染色体进行了显带分析,随后用两种不同的45SrDNA克隆在相同的分裂相进行了荧光原位杂交定位分析。CPD染色在8条粗线期染色体上显示出了10条红色的CPD带纹,在6对有丝分裂中期染色体上显示出了12条CPD带纹。有丝分裂中期染色体上的CPD带纹与粗线期染色体上显著的带纹具有对应性。用改良的CPD染色程序清晰而稳定地显示出这些特征性的CPD带纹为番茄的染色体,特别是有丝分裂中期染色体提供了新的识别标记。用番茄的一个45S rDNA克隆进行的荧光原位杂交,不仅在位于2号染色体短臂的随体上显示了强的杂交信号,而且在粗线期染色体的5个CPD带区或有丝分裂中期染色体的4对CPD带区显示了弱的杂交信号。然而,用来自小麦的45S rDNA克隆pTa71进行的原位杂交却只在随体上显示了杂交信号。鉴于所用的两个45S rDNA克隆在序列上的差异,推断在番茄基因组中只有随体含有45S rDNA单位的编码区,即番茄只有一对45S rDNA位点。

猪小肠黏膜下层脱细胞支架的制备及组织学评价

目的评价不同浓度的十二烷基磺酸钠(SDS)处理猪小肠黏膜下层(SIS)的脱细胞效果,筛选最佳脱细胞浓度,为组织工程化角膜上皮的制备提供支架材料。方法配制0.1%、0.2%、0.3%、0.5%SDS随机分成A、B、C、D 4组,分别脱细胞处理SIS 15min、30min、1h、2h(n=20),同时观察SIS的大体形态变化,HE和4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察脱细胞前后SIS的生物学特性,并对脱细胞支架进行基因组DNA分析(n=5)。结果脱细胞SIS肉眼观察呈乳白色、半透明的膜状物,具有一定的弹性、韧性及透光性;HE和DAPI染色光学显微镜观察结果显示,A组及B组处理30min时SIS生物支架无细胞及DNA残留,组织结构保留完整,胶原纤维间孔隙率增加;A组及B组处理30min脱细胞率可达90%以上。结论 0.1%及0.2%SDS处理30min条件下脱细胞效果较好,能更好地降低SIS的免疫原性,是SDS脱细胞处理SIS比较理想的浓度时间条件,为组织工程化角膜上皮的构建奠定理论基础。

双污泥反硝化除磷-诱导磷结晶工艺中污泥的衰减特征

为调查双污泥反硝化除磷-诱导磷结晶工艺中硝化污泥和除磷污泥的衰减特征,测定硝化细菌耗氧速率(OUR)、聚磷菌PO43--P释放速率(PRR),并利用荧光原位杂交(FISH)技术和DAPI染色方法探究污泥衰减前后目标微生物的分布。研究结果表明:亚硝酸盐氧化细菌(NOB)7 d平均衰减速率为0.41 d-1,呈指数形式衰减,其衰减过程受综合因素影响;而氨氧化细菌(AOB)7 d平均衰减速率为0.13 d-1,呈线性衰减,其衰减过程仅受外源物质影响。在饥饿状态下,聚磷菌(PAO)可通过分解体内贮存的胞内聚合物而获得能量,其衰减速率较低,7 d平均衰减速率为0.11 d-1,且呈线性衰减。污泥中的目标微生物多以团聚体形式存在,且荧光强度与团聚体内微生物数量有关,污泥经过衰减之后,荧光强度弱的团聚体将消失。此外,与单污泥脱氮除磷工艺相比,采用双污泥脱氮除磷工艺有助于硝化细菌和聚磷菌的富集,且通过延长污泥停留时间(SRT)可选择出耐饥饿状态下的目标微生物。

亚麻单倍体抗逆基因的转化

为提高亚麻抗逆性,尽快获得转基因纯系亚麻,本研究采用农杆菌介导的转基因技术,将抗盐和低温胁迫基因HY15CS导入单倍体亚麻,结果获得抗性再生植株24株,从15株生长健壮的再生植株中PCR检测到3株阳性植株,阳性率20%;同时进行了不同方法的单倍体检测技术的研究,确定DAPI染色可以做为快速鉴定植物体倍性常用方法。

石蜡组织荧光原位杂交关键实验步骤探讨

目的：探讨石蜡组织荧光原位杂交（FISH）技术中关键实验步骤的最佳条件，以期提高石蜡切片FISH阳性细胞检出率和实验成功率。方法：在前期标本处理方面，进行双蒸水、0．5×SSC溶液、0．1％硫代亚硫酸钠溶液煮沸对比；在蛋白酶消化方面，设置胃蛋白酶和蛋白酶K两种消化方法，并在37℃条件下设置时间的梯度变化，比较其消化效果；对石蜡切片的变性设置温度梯度，比较杂交检出率；比较DAPI复染时不同浓度对单色、双色FISH结果的影响；应用抗淬灭剂后不同保存时间的对比。结果：采用0．5×SSC溶液煮沸15min，用200μg／mL蛋白酶K在37℃、6～10min条件下消化，可以取得较好的FISH效果；变性温度为81℃时检出率更高，DAPI复染浓度为1000ng／mL时针对单色FISH较合适，而浓度为500、150ng／mL时针对双色／多色FISH有较好的效果。结论：FISH条件经过对比得到优化，对石蜡组织FISH实验具有一定的指导意义。

玉米和类玉米中45S rDNA位点的CPD显带识别

采用CPD(PI和DAPI组合)染色对玉米和类玉米有丝分裂中期染色体进行了显带分析,供试物种所有的45S rDNA位点都能够有效地被CPD染色显示为红色带纹。在栽培玉米、墨西哥玉米、二倍体多年生类玉米中只有一对染色体上具有45S rDNA位点,在多年生类玉米的2对染色体上具有45S rDNA位点。

大鼠神经干细胞体外生长特性

目的 :观察大鼠神经干细胞的体外生长特性。方法 :利用无血清培养基悬浮培养 ,观察神经干细胞的体外生长过程。并比较不同接种密度 ,不同传代时间对神经干细胞生长的影响。用免疫细胞化学技术检测神经干细胞巢蛋白 (nestin)的表达 ;用吖啶橙 (AO) /溴化乙啶 (EB)检测细胞活性 ;用DAPI荧光染料标记细胞。结果 :神经干细胞聚合成细胞团生长 ,细胞团成分复杂。细胞接种密度以 5× 1 0 5个细胞 /ml组生长较好 ;原代细胞生长 3～ 4d后传代为宜。传代后 4d时可获得大量nestin阳性细胞。DAPI标记率为 1 0 0 %。结论 :细胞团成分复杂。神经干细胞要高密度接种 ,及时传代。

苦参碱调控Sirt1/FoxO3信号通路促进胃癌细胞SGC7901凋亡的机制研究

目的研究苦参碱促进胃癌细胞SGC7901细胞凋亡的AKT/FoxO3信号通路机制,为临床新药研发提供参考。方法将生长状态良好的胃癌SGC7901细胞随机分为对照组、Nicotinamide处理组(20μmol/L)、苦参碱低剂量处理组(10μmol/L)、苦参碱高剂量处理组(40μmol/L)。Western Blotting法分析细胞凋亡蛋白Caspase-3/9、Bax/Bcl-2及Sirt1/FoxO3蛋白的表达,DAPI染色分析各组细胞的凋亡情况;免疫细胞化学法分析Sirt1/FoxO3蛋白的表达情况。结果与对照组比较,Nicotinamide组和苦参碱组细胞Bax、Caspase-3/9和FoxO3的表达明显增强(P<0.05),而Bcl-2、Sirt1蛋白的表达明显减弱(P<0.05),DAPI染色凋亡小体明显增多;免疫组织化学发现FoxO3的荧光强度增强(P<0.05),而Sirt1蛋白的荧光强度减弱(P<0.05),且苦参碱的效果有剂量依从性(P<0.05)。结论苦参碱可能通过调控Sirt1/FoxO3信号通路促进胃癌细胞SGC7901的细胞凋亡过程。

冬季桃黄化植原体在树体内分布消长动态的研究

以感染桃黄化病桃树组织作为试验材料,分别利用Nested-PCR技术和DAPI荧光染色技术对冬季桃黄化植原体在树体内的分布进行研究:经Nested-PCR检测黄化桃树叶柄、枝条及根的韧皮部组织均可以扩增得到特异性片段1.2kb,经测序分析为油桃黄化植原体.这表明所检测组织中含有桃黄化植原体;进一步通过DAPI荧光染色观察黄化桃树叶柄、枝条、根及芽胞的韧皮部均可观察到荧光点,结果表明桃黄化植原体在黄化桃树组织中存在于韧皮部组织,冬季在树体内也有分布.

缩球囊霉孢子萌发及细胞核在孢子和芽管中分布的研究

本文研究了从本校分离的丛枝菌根真菌缩球囊霉Glomus constrictum的孢子萌发和萌发孢子的细胞核DAPI(46-diamidino-2-phenylindol)染色。结果显示,G. constrictum孢子直径为179.5-198.7μm ,顶生于产孢菌丝上。经表面消毒处理后,孢子在水琼脂平板上7天开始萌发。DAPI染色后,经稀释荧光计数,单个孢子细胞核数目约为5300,在孢子中无序分布, 细胞核直径约为9.9-11.2μm 。孢子萌发过程中,细胞核总数无明显变化,只是部分细胞核从孢子流向了萌发伸长的菌丝。