多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2蛋白高效表达和纯化

目的在前期的研究中,DAZAP2基因在多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)患者中表达明显下调,可能为MM的负性基因.须进一步获得DAZAP2蛋白,制备抗体,从而在蛋白水平上研究DAZAP2的表达、结构和功能.方法将原核重组质粒pQE30-DAZAP2转化大肠杆菌,阳性菌株经1 mmol/L IPTG诱导表达目的蛋白,再经过纯化和透析.结果IPTG诱导4 hr时,得到大量重组目的蛋白,占可溶蛋白的20%左右,经过Ni-NTA层析柱纯化,获得分子量为17kD的DAZAP2蛋白浓度为0.97 mg/ml.结论DAZAP2蛋白获得高效表达,并且建立快速简便的纯化方法,目的蛋白可以用于下一步的实验.

五指山小型猪DAZAP2cDNA的克隆及其生物信息学分析

为了克隆五指山小型猪DAZ相关蛋白2(DAZAP2)cDNA全长并进行生物信息学分析,试验以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法克隆得到DAZAP2全长cDNA序列,并运用生物信息学软件对其核苷酸序列进行分析,预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。结果表明:五指山小型猪DAZAP2基因的核苷酸序列及其氨基酸序列与人、苏门达腊猩猩、斑马鱼、非洲爪蟾、牛、褐家鼠等动物具有很高的相似性。DAZAP2 cDNA全长943 bp,5'非翻译区长69 bp,3'非翻译区长367 bp,含有1个完整的开放阅读框,编码168个氨基酸。该蛋白的分子质量为17 311 ku,等电点为7.48。

miRNA-543调控DAZAP2基因对胃癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的影响及其机制

目的 检测微小RNA-543(miR-543)在胃癌中的表达及预后价值,进一步探讨miR-543对胃癌细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的影响和作用机制。方法 选取河北医科大学第四医院2019-06-01-2021-10-31收治的50例胃癌组织和癌旁正常黏膜组织作为研究对象,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测50例胃癌和癌旁正常黏膜组织中miR-543的表达,记录患者术后接受替吉奥(5-FU衍生物)联合奥沙利铂(SOX)方案化疗的无病生存期(DFS)。培养正常胃上皮细胞株GES-1、胃癌细胞株AGS和对5-FU耐药细胞株AGS/5-FU,用qRT-PCR法检测miR-543的表达;在miR-543抑制物转染AGS/5-FU细胞株后,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测AGS/5-FU对5-FU的敏感性;qRT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后AGS/5-FU细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、无精症相关蛋白2(DAZAP2)、p53、多药耐药相关蛋白1(MRP1)和胸苷酸合成酶(TS)的表达。生物信息学分析miR-543的靶向基因,并用双荧光素酶报告基因分析对其进行验证。通过DAZAP2回复实验进一步验证miR-543的作用。采用配对t检验比较miR-543在胃癌组织与癌旁正常组织的表达差异;采用独立样本t检验比较抑制miR-543后胃癌5-FU敏感性的差异;采用单因素方差分析探究调控miR-543表达后,Bcl-2、Bax、DAZAP2、p53、MRP1、TS的表达差异。结果 miR-543在胃癌组织中的表达水平(1.031±0.408)高于癌旁正常组织(0.236±0.056),t=13.640,P<0.001;高表达miR-543的患者DFS短于低表达miR-543患者,P=0.008。qRT-PCR法结果显示:miR-543在AGS/5-FU细胞中的表达水平(7.223±1.260)高于GES-1(1.306±0.285)和AGS细胞(3.286±1.166),F=16.050,P=0.004;抑制AGS/5-FU细胞株中miR-543的表达后,AGS/5-FU细胞对5-FU的敏感性(0.452±0.168)增加,F=12.003,P=0.008。生物信息学分析结果显示,DAZAP2是miR-543的直接靶基因。蛋白质印迹法和qRT-PCR法结果显示,在抑制miR-543表达后,AGS/5-FU细胞中Bcl-2、TS表达减少,Bax、DAZAP2、p53表达增加,MRP1表达无明显变化。双荧光素酶报告基因分析证实miR-543对DAZAP2有直接调控功能。在AGS/5-FU细胞中抑制miR-543的同时过表达DAZAP2,发现对5-FU的敏感性增加,Bcl-2、TS、Bax、p53等蛋白的表达有所恢复。结论 miR-543可能通过抑制DAZAP2基因参与胃癌细胞5-FU耐药的形成。