向日葵AGO和DCL基因家族的鉴定和表达分析

为了解向日葵(Helianthus annuus)的Argonaute(AGO)和Dicer-like(DCL)的功能,利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AGO和DCL基因序列在向日葵基因组数据库中进行同源比对,对向日葵AGO和DCL家族成员进行生物信息学分析。结果表明,从向日葵中鉴定到15个HaAGOs和5个HaDCLs家族成员;这2类基因在染色体上的分布均不均匀。系统发育分析表明,与拟南芥相似,HaAGO家族成员可分为3个分支,HaDCL可分为4个分支;所有的HaAGO都具有保守的N domain、DUF1785、PAZ和PIWI结构域,HaDCL家族成员都含有PAZ和RIBOc结构域。表达分析表明,HaDCL3a和HaDCL3b在茎和花序中高度表达;亚细胞定位表明HaAGO多定位于细胞核。这表明向日葵中可能存在典型的RNAi干扰机制,并可能参与了协调向日葵的生长发育过程。

龙眼DCL家族基因的启动子分析及时空表达

为了解龙眼DCL基因的功能,该试验对龙眼基因组数据提取的DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4基因序列进行启动子顺式作用元件及其受miRNA调控的分析;并以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究了DlDCLs不同基因成员在非生物胁迫和外源激素处理下的表达情况。结果显示:(1)龙眼DCL基因启动子中除了TATA和CAAT外,还具有大量的光反应元件、激素应答元件、胁迫响应元件、组织特异性调控元件及植物生长发育相关的顺式调控元件,提示龙眼DCL基因启动子转录活性可能受到光、激素信号及逆境胁迫因素的诱导。(2)对调控龙眼DCL基因的miRNA进行筛选,结果显示DlDCL1受miR162和miR1024调控,DlDCL4受miR390和miR396调控。(3)实时荧光定量PCR显示,在一定浓度范围内,外源激素GA3、ABA和ETH均能下调DlDCLs基因的表达,而高浓度ETH处理则显著上调DlDCLs的表达。(4)高浓度蔗糖(6%)处理时DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4显著上调表达,而低浓度(0.1%)处理时DlDCL1显著上调表达;不同温度处理下,DlDCL1在34℃时显著上升,DlDCL3随着温度的提高相对表达量逐渐减低;而DlDCL2和DlDCL4表达量差异不明显;NaCl胁迫处理下,DlDCLs在1h处理时表达量下调,但在其他不同时间点则上调表达。研究表明,龙眼DCL基因在外源激素及非生物胁迫处理下,并非是简单的一对一响应,而是存在较为复杂的响应机制。

龙眼体胚发生过程中DCL基因的分子特性及表达分析

从龙眼转录组unigene序列筛选获得龙眼DCL基因(命名为DlDCL)全长序列,并结合生物信息学及实时荧光定量等方法,对龙眼DCL基因进行研究,以明确DlDCLs在龙眼体胚、不同生长组织部位中的表达规律及其对激素和光质应答反应,为进一步研究龙眼体胚过程中DlDCLs基因的调控研究奠定基础。结果表明:(1)龙眼转录组数据存在DlDCL1、DlDCL2、DlDCL3和DlDCL4四个DCL家族成员,且基于Unigene的FPKM值发现不同基因在体胚发生阶段具有差异表达。(2)生物信息学分析发现,DlDCLs成员间基本理化性质较为类似,均为亲水性不稳定蛋白、不含信号肽、可进行跨膜运动,但也存在一定差异,如DlDCL2为碱性蛋白,而其他3个成员为酸性蛋白;亚细胞定位预测显示,DlDCLs均定位于细胞核中,但DlDCL2也存在定位于叶绿体中;对DCL蛋白结构域预测显示,DCL是高度保守的蛋白。(3)系统进化树分析显示,不同物种的DCL分为4个分支,同源的DCL蛋白都聚为一类,且DlDCLs与柑橘DCL亲缘关系更为接近。(4)实时荧光定量PCR分析表明,DlDCLs在龙眼非胚性愈伤组织和体胚发生过程中的表达模式差异较大,但DlDCLs在愈伤组织阶段均有较高的表达量,推测DlDCLs在体胚发生过程可能具有功能的独立和协作。DlDCL1和DlDCL2在叶片、花器官等组织部位中的相对表达量较高,暗示DlDCL1和DlDCL2可能参与到光合作用和花器官的发育;DlDCLs还受2,4-D、MeJA、SA激素和光质诱导,表明DlDCLs可能参与激素和光质调控。

高粱基因组DCL家族的系统进化与表达分析

从高粱转录组数据筛选获得SbDCLs基因全长序列,并结合生物信息学方法在高粱的全基因组中鉴定出了6个SbDCLs基因,分布于SBI-01,SBI-03和SBI-06上。其中,SbDCL2a和SbDCL2b在SBI-01上串联重复排列,比较二者基因结构和蛋白质结构域推测SbDCL2a很可能是由SbDCL2b小范围复制所致。SbDCLs蛋白质均为两性蛋白且没有信号肽,亚细胞定位均在细胞核上,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。通过对高粱、水稻、玉米、拟南芥、大豆、小麦、藜麦、甜菜、谷子的DCL蛋白质序列进行系统进化分析,结果表明,DCL存在4个分枝:DCL1,DCL2,DCL3和DCL4;DCL在进化上出现了单双子叶的分化;DCL蛋白编码基因进化具有纯化效应。对SbDCLs基因进行表达分析,结果显示,SbDCLs在高粱穗部、茎节中部、花梗和旗叶茎节表达都比较强烈;SbDCL2a,SbDCL1和SbDCL3a是高度表达基因,而且在生殖器官或组织中相对于营养器官具有更高的表达水平,说明SbDCLs基因对高粱营养生长和生殖发育具有调控作用。SbDCL2b在高粱的整个生育期表达水平均较低,但是在胚珠和花粉中拥有较高的表达水平,可能参与生殖发育调控。

番茄Dicer-like蛋白基因家族生物信息学与表达分析

Dicer-like蛋白(DCLs)是RNA沉默机制中的重要参与者,通过miRNA进行基因调控和植物的抗病毒保护,并且还与其他生物和非生物胁迫有关。研究番茄中DCLs的蛋白质基本功能以及SlDCLs对环境的响应,可以为DCLs参与抗逆途径及其在逆境中的作用提供理论依据。为深入了解番茄中RNase Ⅲ核酸内切酶Dicer-like蛋白基因家族的特征,利用生物信息学的方法对番茄DCL蛋白基因家族成员进行染色体定位,分析蛋白质基本理化性质、系统发育进化、启动子顺式作用元件、蛋白质结构域等。并通过qRT-PCR方法检测基因在组织中的表达模式和对激素、低温、盐、干旱等胁迫的响应。结果表明:番茄DCL基因有7个,分为4个家族;主要蛋白结构域有5个,启动子区域有响应各类激素、光信号、干旱等逆境的顺式作用元件,包括SlDCL1启动子区域的响应低温作用元件,SlDCL2a的SA、ABA响应元件,SlDCL2b的光响应元件,SlDCL2c的ABA,Me-JA响应元件,SlDCL2d的赤霉素响应元件,SlDCL3的Me-JA、SA响应元件,SlDCL4的干旱响应元件。结果表明:DCL家族基因在不同组织中具有不同的表达模式;激素、低温和渗透胁迫处理可以抑制或激活该家族成员的表达。SlDCL1直接响应低夜温,SlDCL2a对渗透胁迫响应明显;SlDCL2b的转录水平受到NACl的负调控;SlDCL2c受到低温以及ABA的正调控;SlDCL2d受NACl与PEG的负调控;PEG可以促进SlDCL3和SlDCL4的表达。

氟虫腈对PC12细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达的影响

目的 研究氟虫腈对神经细胞凋亡的影响并初步探讨其神经毒作用机制.方法 设3.13×10^-6、1.25×10^-5、5.00×10^-5mol/L 3个氟虫腈染毒组和1个对照组,用荧光显微镜检测各组PC12细胞凋亡荧光强度并用流式细胞仪对凋亡率进行测定,并对3个染毒组Bcl-2蛋白表达进行荧光强度检测.结果 细胞凋亡荧光强度检测发现,3.13×10×10^-6mol/L染毒组细胞凋亡率为17.00%±0.57%,5.00×10×10^-5mol/L染毒组细胞坏死率为13.95%±1.95%,均明显高于对照组（分别为9.80%±0.30%、3.10%±0.40%）,差异均有统计学意义（P〈0.05）.对Bcl-2蛋白表达含量进行定性检测,结果显示,3.13×10^-6mol/L染毒组Bcl-2蛋白表达明显低于对照组,其他染毒组Bcl-2蛋白表达与对照组比较无明显差异.结论 氟虫腈在较低剂量时可能是通过影响Bcl-2蛋白表达来诱导PCI2细胞凋亡,而在较高剂量时可能通过其他非细胞凋亡途径直接致细胞坏死发生.