DcR3、ALT与AFP联合检测对肝细胞癌的诊断价值

探讨血清诱骗受体3(decoy receptor,DcR3)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和甲胎蛋白(alpha fetoprotein ,AFP)联合检测对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的临床诊断价值。 方法 选取127例临床诊断为HCC的患者作为研究对象(HCC组)。采用ELISA检测DcR3,全自动生化分析检测ALT、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST),γ-谷氨酰胺转移酶(γ–glutamyl transpeptidase,γ-GGT)), 总蛋白(Total protein,TP),白蛋白(AlbuminALB)及AFP化学发光法测定的水平。采用受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析DcR3及相关实验室指标对HCC患者的诊断价值。比较两组间的差异采用t检验,P<0.05认为统计有统计学意义。 结果 HCC 组中的临床指标DcR3、AFP 、ALT、AST、GGT的检测水平明显高于对照组(P < 0.01),而HCC 组的TP、ALB水平较低(P < 0.01)。DcR3、ALT和AFP联合检测对HCC的诊断灵敏度为96.3%,而单项检测的诊断敏感性分别为85.2%、92.6%和81.5%。 结论DcR3、ALT和AFP联合检测提高了HCC的诊断敏感性,升高的DcR3对HCC可能具有很重要的诊断价值。

DcR3及其配体的研究进展

DcR3/TR6是最近发现的可溶性TNFR超家族成员,在归类上属于第三类,其配体具有多样性。它可竞争性地与FasL、LIGHT及,TL1A结合,在肿瘤免疫、移植免疫、自身免疫及抗感染免疫中都发挥着重要的作用。本文拟就DcR3及其配体的研究进展作一综述。

肝癌发展中FasL及其受体Fas/DcR3的表达分析

目的研究小鼠肿瘤发生早期肿瘤坏死因子超家族成员FasL及其受体的表达特点,及其与免疫调节相关分子表达的时空关系,探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用。方法建立小鼠实体瘤模型,采用RT-PCR方法检测肿瘤组织中可溶型FasL、Fas及DcR3、TGF-β、IL-10在肿瘤发生不同时相的表达,同时,应用ELISA方法定量检测血清中TGF-β、IL-10的表达。结果在早期的肿瘤组织中,Fas的表达先于DcR3,其后DcR3大量表达,而Fas的表达则下调直至丢失,DcR3、FasL同时表达并上调,TGF-β和IL-10也随肿瘤的表达而上调。TGF-β同DcR3的表达具有空间位置的一致性。FasL、DcR3、TGF-β和IL-10的表达水平同肿瘤的生长呈正相关。结论随着肿瘤不断的生长,肿瘤局部的免疫应答逐渐趋向于负调节,FasL、DcR3在诱导肿瘤免疫耐受的过程中可能发挥着重要作用。

结肠癌患者外周血DcR3与CEA联合测定的临床价值

目的联合检测结肠癌患者外周血中DcR3与癌胚抗原(CEA)mRNA的水平,建立取材于外周血的早期诊断结肠癌的新方法。方法44例结肠癌患者和30名健康志愿者,各取5 mL静脉血,肝素抗凝,密度梯度离心法分离外周血单核细胞,细胞总RNA TRIzol提取液提取外周血单核细胞总RNA,用半定量RT PCR法检测外周血单核细胞中DcR3与CEA mRNA的水平,并用t检验进行比较。结果结肠癌患者外周血中DcR3基因的相对表达水平为0.415±0.078,与健康对照组(0.235±0.074)比较有显著性差异(P<0.05),但患者之间没有明显差异(P>0.05)。CEA在结肠癌患者外周血中阳性率为36.4%(16/44),表达水平为0.346±0.071。30名健康志愿者均为阴性。结论DcR3基因在结肠癌患者外周血中表达水平明显高于健康人,其表达水平与结肠癌有相关性。在CEA阴性情况下,DcR3可能成为新的肿瘤标志物。

抗人DcR3单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的制备抗DcR3单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性,并应用于ELISA、Western blot、Flowcytometry(FCM)检测。方法以纯化的可溶性DcR3(sDcR3)免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DcR3 mAb。用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗DcR3mAb的亚类。用ELISA方法测定抗DcR3 mAb与sDcR3结合的特性,SDS-PAGE鉴定抗DcR3 mAb与SW480细胞上清中DcR3结合的特性,以鉴定mAb的特性。用间接ELISA法检测腹水mAb的效价、亲和常数并进行表位分析。Western blot检测mAb的特异性及应用,并用所获抗DcR3单克隆抗体(mAb)通过流式细胞仪检测肿瘤细胞表面DcR3的表达水平。结果获得4株可分泌DcR3 mAb的杂交瘤细胞系ZZ-393、ZZ-394、ZZ-151和ZZ-268。其中DcR3 mAb ZZ-268(下文简称为ZZ-268)的Ig亚类为IgG1(κ型);腹水效价为1×10-5;亲和常数为1.28×109水平;ZZ-268和ZZ-151可识别与其他2种抗体不同的抗原表位;Western blot证实,获得的ZZ-268可特异性地识别DcR3;通过流式细胞术可敏感地检测到不同肿瘤细胞表面DcR3的表达水平。结论获得4株抗DcR3的mAb,其中ZZ-268效价高、特异性强,将此抗体用于膜DcR3与sDcR3的检测分析。

血清HIF-1α、DcR3、TSGF在宫颈癌诊断中的作用及其与患者临床病理参数的关系

目的观察血清缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、诱骗受体3(DcR3)、恶性肿瘤特异生长因子(TSGF)在宫颈癌诊断中的作用,并探讨其与患者临床病理参数的关系。方法选取体检女性2 250例,根据体检及病理诊断结果分为健康组1 342例、宫颈良性病变组836例、宫颈癌组72例。采用ELISA法检测三组血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价三者单独及联合诊断宫颈癌的价值,比较不同临床病理参数的宫颈癌患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平。结果宫颈癌组血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平均高于宫颈良性病变组、健康组(P均<0.05)。血清HIF-1α、DcR3、TSGF联合诊断诊断宫颈癌的AUC(0.891)高于三者单独诊断的AUC(0.791、0.812、0.789)。血清HIF-1α、DcR3、TSGF单独诊断宫颈癌的截断值分别为172.38 pg/mL、492.70 pg/mL、65.51 U/mL,灵敏度分别为68.06%、75.00%、69.44%,特异度分别为81.82%、78.61%、80.85%,三者联合诊断宫颈癌的灵敏度、特异度分别为75.00%、86.74%。FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期、淋巴结转移、组织学低分化、宫颈浸润深度≥2/3的宫颈癌患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平均高于FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移、组织学中高分化、宫颈浸润深度<2/3者(P均<0.05)。不同年龄、肿瘤直径患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论宫颈癌患者血清HIF-1α、DcR3、TSGF水平均升高,三者联合检测有助于宫颈癌的诊断及病情评估。

结肠癌中DcR3和livin表达与预后的关系

目的探讨DcR3和livin在结肠癌组织中的表达与预后的关系。方法采用二步法免疫组化技术(Envision),检测62例术前未经化疗的结肠癌组织中DcR3和livin基因的表达情况。结果 62例结肠癌组织中DcR3阳性表达率56.5%(35/62);而livin阳性率48.4%(30/62)。DcR3和livin表达与结肠癌组织学类型、浸润深度、临床分期和淋巴结转移有明显相关性(P<0.05);与患者年龄、性别、肿瘤大小等无关(P>0.05)。DcR3在livin阳性和阴性患者中阳性率分别为68.6%(24/35)和22.2%(6/27),两者差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌DcR3和livin均阴性表达病例的5年生存率高于DcR3和livin均阳性表达者,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DcR3和livin异常表达可促进结肠癌的发生发展,同时两者具有协同作用,其与肿瘤的恶性程度与生存率有关;联合检测DcR3和livin更有助于判断结肠癌的发展趋势,为临床诊治及判断预后提供新的路径。

TRAIL及其受体DR4、DcR1在大肠癌及癌旁组织中的表达

目的研究人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL)及其受体DR4、DcR1在大肠癌和癌旁组织中的表达及意义。方法采用免疫组化SP法检测42例大肠癌及其癌旁5cm组织、25例正常大肠粘膜组织中TRAIL及其受体DR4、DcR1表达水平。结果TRAIL及DR4在大肠癌、癌旁组织及正常大肠粘膜组织中的表达呈递增趋势,而DcR1的表达则与之相反(P<0.05);TRAIL和DR4在中、低分化癌中的表达明显低于高分化癌中的表达,而DcR1的表达则与之相反(P<0.01);TRAIL、DR4、DcR1的表达与肿瘤的病理类型、Duke′s分期及淋巴结转移与否等因素无关(P>0.05)。结论TRAIL、DR4、DcR1可能与大肠癌的发生、发展密切相关;DR4可能在TRAIL诱导的凋亡通路中发挥一定作用,而DcR1的表达与否一定程度上决定了TRAIL能否发挥其生物效应。

基于miR30的靶向DcR_3慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的构建基于miR30的靶向DcR3慢病毒干扰载体。方法人工设计针对DcR3编码区的干扰序列,使其转录后RNA结构类似于miR30结构,茎杆序列替换成DcR3序列,送上海生物工程技术服务有限公司合成。以该序列为模板,分别利用携带EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物行PCR扩增,通过酶切连接的方式将插入片段连入p201慢病毒载体骨架中。经酶切和测序鉴定后,用包装质粒pMD2G及包膜质粒psAX2共同转染293FT细胞进行病毒包装。病毒包装上清液加入培养的人食管鳞癌细胞系KYSE150细胞中,用FACS分选后进行RT-PCR和Western blot检测DcR3表达情况。结果构建了针对DcR3的3条慢病毒干扰载体,成功包装出病毒,并不同程度地抑制了DcR3蛋白的表达。结论基于miR-30的DcR3能有效抑制DcR3表达,为进一步研究DcR3功能打下了基础。

PTEN、Fas/FasL和DCR3在胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:研究PTEN、Fas/FasL和DCR3在人胃癌组织中的表达,初步探讨三者与胃癌的发生、癌细胞增殖和侵袭转移的关系及其临床意义。方法:采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法检测75例胃癌标本黏膜组织中PTEN、Fas/FasL和DCR3蛋白的表达,15例胃溃疡或十二指肠溃疡患者胃黏膜组织作为正常对照组。结果:胃癌组织中DCR3的表达率显著高于正常胃黏膜组织,PTEN及Fas/FasL的表达率则低于正常胃黏膜组织,差异均有统计学意义(P<0.01);DCR3与Fas/FasL、PTEN的表达呈负相关(P<0.001),PTEN与Fas/FasL的表达呈正相关(P<0.001,r=0.401),三者的阳性表达率与肿瘤淋巴转移、临床分期、肿瘤病理分化程度及浸润深度密切相关,与性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)。结论:DCR3、PTEN及Fas/FasL在胃癌的发生发展及浸润转移中存在着相互制约的关系。检测三者在胃癌中的表达,有助于从不同角度判断胃癌的恶性生物学行为;DCR3、PTEN及Fas/FasL有可能成为胃癌临床诊断、判断疗效及监测预后的可靠指标。

DcR3重组蛋白对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关分子的表达及细胞凋亡的作用

目的:研究诱骗受体3(DcR3)在正常大鼠、糖尿病(DM)大鼠心肌组织的表达,DcR3重组蛋白对心肌组织凋亡相关分子表达以及心肌细胞凋亡的影响,探讨DcR3对DM大鼠心肌细胞凋亡的作用。方法:一次性腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DM模型,尾静脉注射不同剂量的DcR3重组蛋白[1.2 mg/(鼠·d)、0.8 mg/(鼠·d)、0.4 mg/(鼠·d)]40 d。RTPCR检测心肌组织DcR3 mRNA、Fas mRNA、FasL mRNA的表达。Wester blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-8的表达。双抗夹心ELISA检测血液中IL-1β、TNF-α及LFN-γ水平的变化,HE染色观察心肌细胞凋亡的百分率。结果:DcR3治疗组大鼠与DM组比较心肌组织DcR3 mRNA高表达,Fas mRNA、FasL mRNA表达下调。Caspase-8蛋白水平下调,Bcl-2蛋白水平上调,以中剂量组的作用最明显。各DcR3治疗组血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01)。心肌细胞凋亡的百分率下降(P<0.05)。结论:DcR3重组蛋白有抑制DM大鼠心肌细胞凋亡的作用,其机制与竞争Fas,阻断FasL诱导细胞凋亡,心肌细胞表达DcR3,凋亡相关因子Caspase-8下调、Bcl-2上调及细胞因子水平的降低有关。

DcR3 mRNA在白血病细胞中的表达及意义

目的:探讨DcR3 mRNA在急性白血病(AL)细胞中的表达及其临床意义。方法:选择AL患者46例,其中急性髓系白血病(AML)28例,急性淋巴细胞白血病(ALL)18例,27例非恶性血液病患者作为对照组,采用RT-PCR方法检测骨髓单个核细胞(BMNC)中DcR3 mRNA的表达水平,并分析其与临床参数的关联性。结果:AL组DcR3 mRNA表达阳性率(67.4%)及表达水平(0.56±0.09)高于对照组(40.7%,0.39±0.19)(P<0.05);AML组DcR3 mRNA表达阳性率(71.4%)及表达水平(0.56±0.09)与ALL组(61.1%,0.53±0.08)比较差异无显著性(P>0.05);AL患者DcR3 mRNA的阳性表达率在白细胞计数≥30×109.L-1时升高。结论:DcR3基因可能通过抑制白血病细胞凋亡途径参与白血病发病过程。

诱骗受体DcR3的基因构建、表达及特异性鉴定

目的:构建适于原核表达的人诱骗受体DcR3基因,并进行重组蛋白的表达纯化及特异性鉴定。方法:查得人DcR3cDNA全序列,将其分段设计引物,通过重叠PCR获得DcR3基因。构建pET-22b(+)/DcR3表达载体,转化大肠杆菌Rosseta-gami,IPTG诱导表达,Ni柱纯化。采用ELISA进行特异性鉴定。结果:通过重叠PCR获得了编码正确氨基酸序列的目的基因。目的蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后,蛋白纯度达95%以上。ELISA结果表明所纯化的蛋白可与抗DcR3抗体发生特异结合。结论:诱骗受体DcR3基因的成功构建、表达及纯化,为进一步的功能研究奠定了基础。

胃癌组织中Survivin和DcR3基因的表达及临床意义

目的探讨胃癌组织中Survivin和DcR3基因的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测50例胃癌组织及其对应的50例正常胃黏膜中Survivin、DcR3 mRNA的表达情况。结果胃癌中Survivin、DcR3 mRNA的阳性表达率均明显高于正常胃黏膜组织(均P<0.01),二者的表达水平在胃癌中呈正相关(P<0.01);Survivin、DcR3 mRNA的表达水平均与胃癌的组织分化程度、淋巴转移、TNM分期有关(均P<0.05)。结论联合检测Survivin和DcR3有助于判断胃癌预后,可能是临床评价胃癌恶性程度的重要指标。

宫颈癌组织中DCR3表达与外周血T细胞亚群的相关性研究

目的探讨宫颈癌组织中诱骗受体3(DCR3)表达与外周血T细胞亚群之间的相关性。方法免疫组织化学法检测宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌(CC)及正常宫颈组织中DCR3表达情况,并检测宫颈癌组织中实质及间质内T细胞表面抗原CD3、CD4、CD8阳性细胞数量;应用流式细胞术分析患者外周血中CD3+、CD4+、CD8+T数量变化情况,分析研究宫颈癌组织中DCR3表达与患者外周血T细胞亚群之间的相关性。结果 DCR3表达强度与宫颈病变严重程度有关;宫颈癌患者外周血中T细胞数明显降低,且宫颈组织中DCR3表达与患者外周血中CD3+T、CD4+/CD8+呈负相关;宫颈癌变后实质内T细胞数明显减少,T细胞主要聚集于肿瘤间质内。结论 DCR3参与了宫颈癌细胞免疫逃逸,外周血T细胞亚群联合DCR3检测可作为宫颈癌免疫诊断指标,为患者免疫治疗提供基础。

特发性肺间质纤维化病人外周血单核细胞中DcR_3基因表达的意义

目的 探讨外周血单核细胞 (PBMC)中DcR3基因表达水平与特发性肺间质纤维化 (IPF)的关系。方法 1 4名IPF病人和 1 0名健康对照各取 5ml静脉血 ,肝素抗凝 ,密度梯度离心法分离PBMC ,异硫氰酸胍 酚 /氯仿法提取PBMC总RNA ,用半定量RT PCR法检测PBMC中DcR3基因的相对表达水平 ,并用t检验进行比较。结果 IPF病人组PBMC中DcR3基因的相对表达水平为 0 375± 0 0 88,与正常对照组 (0 2 59±0 0 84)相比有明显差异 (P <0 0 5)。结论 IPF病人PBMC中DcR3基因的表达水平增高。

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a(+)/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a(+)/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的：制备抗人DcR3单克隆抗体（mAb），并鉴定其特异性。方法：纯化的His．DcR3融合蛋白免疫小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化，纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价。结果：获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞，均属IgG1亚型，其腹水抗体效价为1×10^-5～1×10^-7，Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白，其中1株（181）可与SW480细胞成分反应。结论：成功建立稳定分泌抗人DcR3mAb的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体特异性强、效价高，为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础。

子宫内膜癌中TRAIL受体DR5、DcR1及P-gp的表达及意义

目的探讨TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)受体DR5、DcR1及多药耐药基因MDR1产物P-gp在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义。方法采用免疫组化Elivision TMplus法检测DR5、DcR1、P-gp蛋白在子宫内膜癌中表达。结果在子宫内膜癌中,DR5、DcR1、P-gp阳性表达率为85.71%,45.24%,52.38%。DR5的阳性表达与病理分级及肌层浸润有关,P-gp的阳性表达率与临床分期成正比,子宫内膜癌中P-gp与DR5的阳性表达呈负相关,P-gp与DcR1的阳性表达呈正相关。结论子宫内膜癌中DR5的高表达是TRAIL用于子宫内膜癌治疗的依据;晚期子宫内膜癌中P-gp高表达可能导致其对化疗耐药性增加;凋亡调节基因与耐药基因之间可能存在着某种内在的关系。