DD3 mRNA在前列腺癌组织中定量表达分析

目的:探讨DD3基因在前列腺组织中表达的临床意义。方法:用荧光定量RT-PCR方法对21例前列腺癌(PCa)组织、27例非前列腺部位的肿瘤组织、39例良性前列腺增生(BPH)组织和15例正常前列腺组织中的DD3的表达进行了定量分析,用ROC曲线对DD3 mRNA诊断PCa的性能进行了分析。结果:27例非前列腺组织中均未检测到DD3基因的表达。DD3在PCa组、BPH组和正常前列腺组表达量的中位数分别为7.2×106、2.5×104、1.5×104拷贝/mg组织。PCa组较BPH组和正常前列腺组DD3的表达量显著增高(P<0.01),而BPH组和正常前列腺组间则差异无显著性(P>0.05)。DD3表达量与临床分期和分化程度之间均无明显相关性。DD3 mRNA曲线下面积(AUC-ROC)为0.937(95%CI:0.879～0.995)。当临界值为1.4×105拷贝/mg组织时,灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性拟然比(+LR)、阴性拟然比(-LR)分别为90.5%、85.0%、86.7%、76.0%、94.3%、6.03和0.11。结论:DD3 mRNA的表达仅限于前列腺组织,具有良好的组织特异性。DD3 mRNA表达在PCa组织中显著升高,在正常前列腺和BPH组织中差异无显著性。DD3 mRNA可作为PCa诊断的良好标志物,在PCa早期诊断、微转移诊断、预后判断、指导治疗等方面也具有潜在的应用价值。

荧光实时定量RT-PCR检测DD3mRNA方法的建立

目的建立荧光实时定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测前列腺癌（PCa）特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法，并进行方法学评价。将PCR扩增产物经凝胶电泳纯化后与pBluescript Ⅱ SK载体连接，再将重组质粒转化感受态细胞进行克隆；提取重组质粒在紫外分光光度计上定量，作为定量检测的标准品。结果重组质粒经PCR扩增及序列测定，表明pBluescriptⅡSK—DD3cDNA克隆成功。PCR扩增产物经测序分析证实为DD3 mRNA特异性片段。本法灵敏度为6拷贝／反应，线性范围为6～6×10^8拷贝／反应，相关系数为0．9985，批内、批间变异系数分别为1.0％～2.0％和1、3％～6、6％。结论成功建立了FQ—RT—PCR检测DD3mRNA的方法。为DD3 mRNA作为前列腺癌的诊断指标提供了方法学依据，也为其他肿瘤基因的检测提供了方法学启示。

前列腺癌特异DD3基因实时荧光定量PCR检测方法建立及初步应用

目的:建立实时荧光定量PCR检测特异DD3基因方法,探讨其在前列腺癌早期诊断中的应用价值.方法:根据Genebank中的DD3mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,构建用于制备DD3基因检测的定量标准品的克隆载体;建立DD3基因的实时荧光定量方法,分别用于前列腺癌患者全血、尿液、前列腺液标本的检测.结果:经稳定性、特异性、重复性和敏感性实验评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64×103拷贝/L,线性范围为1.64×103～1.64×1015拷贝/L.对临床收集的19份前列腺癌患者,20份非前列腺癌患者、30份健康者的全血、尿液及前列腺液标本进行检测.19份前列腺癌患者标本中阳性率分别为100%(全血)、80%(尿液)、100%(前列腺液);20份非前列腺癌患者标本中只有1份前列腺液出现低拷贝值(1×105拷贝/L);30份健康者标本均为阴性.在全血、尿液、前列腺液标本中,前列腺癌患者DD3mRNA含量明显高于非前列腺癌患者和健康者(P<0.05).结论:DD3基因是一种用于前列腺癌早期诊断的特异性指标,可用于生物体液中少量癌细胞的检测,在前列腺癌早期诊断、微转移诊断、预后判断、指导治疗等方面均具有潜在的应用价值.

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法，为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法根据Genebank中的DD3mRNA全序列，设计DD3基因的特异引物和探针，采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价，DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1．64copy/ml，线性范围为1．64-1．64×10^12copy/ml.结论DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立，将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.

尿液DD3mRNA定量检测在前列腺癌诊断中的价值

目的探讨前列腺按摩后尿沉渣中DD3mRNA含量在前列腺癌诊断中应用价值。方法收集前列腺癌(Pca)患者18例、良性前列腺增生(BPH)33例,在前列腺穿刺活检前收集前列腺按摩后的尿液,离心取细胞沉淀物,用荧光实时定量RT- PCR方法检测DD3 mRNA和PSAmRNA含量,以PSAmRNA作为管家基因校正尿沉渣中的前列腺细胞,以DD3mRNA/PSAmR- NA比值表示尿DD3mRNA含量。用ROC曲线对DD3mRNA诊断PCa的性能进行分析,并与血清tPSA进行了比较,同时探讨了尿DD3mRNA阳性率与临床分期和病理分级的关系。结果Pca患者尿DD3mRNA表达量明显高于BPH患者,差异具有统计学意义(P【0.05)。ROC曲线分析结果显示,ROC-AUC=0.716(95%CI:0.572～0.861)。当截断值为0.118时,DD3mRNA的灵敏性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比分别为67.0%、78.8%、77.4%、63. 2%、83.9%、3.41和0.35。若血清tPSA分别以4ng/ml和10ng/ml为截断值时,灵敏度分别为100%和94.4%,特异度分别为15.25和57.6%。DD3mRNA的阳性率与临床分期和病理分级无关。结论DD3mRNA的特异性明显高于血清PSA,尿液DD3mRNA的检测可减少不必要的前列腺穿刺,作为PCa的一种非损伤性诊断方法具有良好的应用前景。

前列腺癌组织中DD3和PSA基因定量表达与临床意义

目的探讨DD3和PSA基因在前列腺癌组织中定量表达及其临床意义。方法用实时荧光定量RT-PCR方法对21例前列腺癌组织(PCa)、39例良性前列腺增生(BPH)组织中DD3mRNA和PSAmRNA含量进行检测,用ROC曲线对DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA等指标对前列腺癌诊断价值进行评价。结果LNCaP细胞株中PSAmRNA含量约为DD3mRNA的4000倍。PCa组织中DD3mRNA和PSAmRNA含量以及DD3mRNA/PSAmRNA比值均显著高于BPH组织,差异具有统计学意义(P【0·01),但PCa不同临床分期和分化程度间差异无统计学意义(P值均】0·05)。ROC曲线分析结果显示,DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA的曲线下面积(AUC-ROC)分别为0·937(95%CI:0·879~0·995)、0·755(95%CI:0·629~0·880)和0·839(95%CI:0·738~0·940)。当DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA临界值分别为1·4×105copies/mgtissue、3·0×107copies/mgtissue和5·0×10-3时,灵敏度分别为90·5%、81·0%和81·0%;特异度分别为85·0%、62·0%和66·7%。若将DD3mRNA和PSAmRNA联合用于PCa的诊断,其特异性与DD3mRNA相同,特异性均为85·0%,灵敏度可达100%。结论PCa组织DD3mRNA、PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA较BPH组织显著增高,DD3mRNA用于PCa的诊断性能均优于PSAmRNA和DD3mRNA/PSAmRNA,DD3mRNA和PSAmRNA的联合检测时特异度与DD3mRNA相同,但可明显提高灵敏度,对PCa的早期诊断具有重要意义。

靶向前列腺癌并携带SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒的构建

目的:构建DD3启动子调控并携带SATB1基因shRNA溶瘤腺病毒,研究其对前列腺癌的特异抗肿瘤作用。方法:以pSilencer3.1-SATB1为模板,通过PCR扩增出SATB1-shRNA表达框并克隆至pZD55载体,构建重组质粒pZD55-SATB1-shRNA。EcoRⅤ和XbaⅠ分别酶切pZD55-SATB1-shRNA和pZXC2-DD3-E1A,将目的片段连接重组,获得质粒pDD3-ZD55-SATB1,将其与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染293细胞。PCR鉴定正确者即为溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1。扩增,纯化,测病毒滴度。结晶紫染色观察对前列腺癌细胞毒性;Western印迹检测E1A在列腺癌细胞中的表达;RT-PCR和Western印迹检测列腺癌细胞中SATB1基因沉默效果。结果:成功构建DD3启动子调控同时携带SATB1-shRNA的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1,初步证实DD3-ZD55-SATB1复制具有高度的前列腺癌靶向性和特异的SATB1基因沉默效果。结论:成功构建的溶瘤腺病毒DD3-ZD55-SATB1为进一步体内外研究其对前列腺癌的治疗作用奠定基础。

DD3和PSA基因在前列腺癌组织中的定量表达分析

目的探讨DD3 mRNA和PSA mRNA在前列腺组织中表达的临床意义及诊断前列腺癌(PCa)的价值。方法荧光定量RT—PCR法分析21例PCa组织、39例良性前列腺增生(BPH)组织DD3 mRNA和PSA mRNA的表达,ROC曲线对DD3 mRNA、PSA mRNA和DD3 mRNA／PSA mRNA比值诊断PCa的价值进行分析。结果PCa组织中DD3 mRNA、PSA mRNA表达量和DD3 mRNA／PSA mRNA比值均显著高于BPH组织,差异有统计学意义(P<0．01)。不同临床分期和分化程度之间DD3 mRNA、PSA mRNA和DD3 mRNA／PSA mRNA比值差异无统计学意义(P值均>0．05)。ROC曲线分析结果显示,DD3 mRNA、PSA mRNA和DD3 mRNA／PSA mRNA的曲线下面积分别为0．937、0．755和0．839。当DD3 mRNA、PSA mRNA和DD3 mRNA／PSA mRNA临界值分别为1．4×105拷贝／mg组织、3．0×107拷贝／mg组织和5．0×10-3时,敏感性分别为90．5％、81．0％和81．0％,特异性分别为85．0％、62．0％和66．7％。若将DD3 mRNA和PSA mRNA联合用于PCa的诊断,其特异性与DD3 mRNA相同,为85．0％,敏感性可达100．0％。结论PCa组织中DD3 mRNA和PSA mRNA表达量均增加,但组织中DD3 mRNA的定量检测更具诊断价值,联合检测有利于提高诊断敏感性,对PCa的诊断具有一定临床应用价值。

环介导等温扩增法检测血浆游离DD3mRNA在前列腺癌诊断中的价值

目的:采用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术进行前列腺癌(PCa)特异基因DD3检测,探讨其诊断PCa的可行性。方法:选择血清PSA异常者60例,行前列腺穿刺活检的同时留取血标本;另留取15例正常男性血进行DD3检测,将DD3检测结果和前列腺病理检查结果进行比较,探讨血DD3mRNA在PCa诊断中的临床应用价值。结果:60例血清PSA异常者中,27例病理检查诊断为PCa,这些患者均检测到DD3表达,33例前列腺增生患者中有1例DD3阳性表达,15例正常对照组均未见DD3阳性表达。结论:LAMP法检测DD3与病理检测具有极高的一致性,方法简单、快速,可大大减少不必要的前列腺穿刺活检,对PCa的诊断具有重要的临床指导价值。