猪流感病毒通用型微滴式数字RT-PCR绝对定量检测方法的建立

为建立灵敏且可绝对定量检测猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的微滴式数字RT-PCR(ddRT-PCR)方法,以SIV M基因的保守序列为靶基因,设计并合成一套特异性引物和TaqMan探针,建立了可对主要流行的H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV绝对定量检测的通用型ddRT-PCR方法。随后,对该方法的敏感性、特异性和重复性进行评价,并利用临床猪鼻咽拭子样品进行检测验证。结果显示:建立的ddRT-PCR方法检测限达到1.6 copies/µL,灵敏度极高;能特异性检出H1N1、H1N2和H3N2亚型SIV,与猪瘟病毒等其他常见猪病病原均无交叉反应;重复检测结果的批内和批间变异系数(CV)分别为0.75%、3.17%,重复性良好;经临床样品检测验证,建立的ddRT-PCR和荧光RT-qPCR方法分别检出阳性样品72、66份,提示前者在检测低病毒拷贝样品时较荧光RT-qPCR更优。结果表明,本研究建立的SIV通用型ddRT-PCR方法灵敏度高,特异性和重复性均良好,且在检测低病毒含量临床样本时更具优势,可作为一种对SIV感染进行早期诊断和绝对定量检测的有效方法。

小麦光温敏雄性不育相关基因的DDRT-PCR分析及功能预测

以小麦光温敏雄性不育系BS210为试材,分别在北京顺义(可育环境)和安徽阜阳(不育环境)两种诱导育性表现的生态环境下种植,并于雌雄蕊分化期、药隔形成期、花粉母细胞形成期、四分体期和单核期5个时期提取小穗组织的RNA,利用DDRT-PCR方法分离不育系在光、温因子诱导下的差异表达mRNA,并通过反向Northern进行验证.对获得的20条差异表达的EST进行了测序和BLAST分析,得到了4个候选基因的片段,对其进行5′Race扩增、序列分析及功能预测.结果表明它们分别与水稻的DNA修复重组蛋白基因rad50、小麦穗部表达的LRR重复序列型类受体激酶基因、玉米叶片坏死斑点L1s1基因的序列相似性分别为89%、89%和88%,另外还筛选到1个未知功能的新基因片段,它和rad50分别在可育和不育环境下表达的mRNA具有相同的5′端编码区,但3′端非编码区序列出现长度差异.研究结果为深入探讨小麦光温敏雄性不育机理提供了有意义的理论依据.

利用DDRT-PCR技术分离和克隆玉米抗大斑病相关基因片段

分离和克隆农作物的抗病基因是植物病理学及分子生物学研究的热点领域,笔者以一套含有不同主效抗病基因的玉米自交系B37,B37Ht1,B37Ht2为试验材料,接种玉米大斑病菌0号小种菌株01-27后,利用mRNA差异显示反转录PCR(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRTPCR)技术分离玉米抗大斑病相关基因片段.通过反式Northern杂交检测,共获得了44条差异表达基因片段,其中与B37亲和性互作相关的片段17条,与B37Ht1和B37Ht2非亲和性互作相关的片段分别为11条和8条.

改良DDRT-PCR研究苦参碱诱导K562细胞分化相关的差异表达基因

The differentiation of human leukemia K562 cells can be induced by matrine. To investigate the mechanism of the induced cell differentiation, an improved DDRT PCR technique was applied to screen the differentially expressed genes between K562 cells and the matrine treated cells. The sequences of the fragments of the differentially expressed genes were obtained by sequencing following the T A cloned fragments identified by restriction endonuclease, and analyzed with bioinformatics. The results indicated that the multiple gene expression known already changed in the process of induced cell differentiation and an unknown gene fragment was cloned. It suggested that the differentially expressed genes acted as cell differentiation related genes involved in the early phase of the induced cell differentiation.

利用改进的DDRT-PCR分离并鉴定水稻细胞缺铁胁迫相关cDNA克隆

利用改进的差异显示PCR(DDRT-PCR)技术从水稻细胞中分离与缺铁胁迫相关的新基因。在分离到的8个差异片段中,通过Northern杂交验证,其中5个为阳性。在这5个阳性片段中有3个是受缺铁胁迫抑制,有2个受缺铁胁迫诱导表达。对这些阳性片段的序列分析表明有3个(IDR2,IDR3,IDR8)为新基因。其中IDR2、IDR8是2个未知基因,IDR3通过GenBank搜索可以找到一些与它同源的已知基因片段。

DDRT-PCR技术分析籽粒苋镉胁迫下相关基因的差异表达

以镉污染修复植物籽粒苋(Amaranthus hypochondriacus)的根、叶、果为实验材料,利用DDRT-PCR技术分析籽粒苋Cd胁迫下基因表达水平的变化。结果表明:回收差异片段获得镉处理诱导的4个差异表达序列(EST-1、EST-2、EST-3和EST-4),经Blastn比对,EST-1与土人参26S核糖体RNA基因部分序列(GB|HQ843466.1)一致性为99%,EST-2与虎耳草26S核糖体RNA大亚基基因部分序列(GB|AF036498.1)一致性为93%,EST-3与大肠杆菌菌株TW14359 DNA聚合酶Ⅲα亚基基因(ECs0186)完整CDS(GB|EU906049.1)一致性为97%,EST-4与米曲霉RIB40β-葡萄糖苷酶基因(XM_001816779.2)一致性为99%;经Blastx比对,EST-1与假定蛋白MTR_5g051030[苜蓿](XP_003614386.1)氨基酸序列相似性为26%,EST-2与假定衰老相关蛋白[柏杉](GB|ACA30301.1)氨基酸序列一致性为98%,EST-3与DNA聚合酶Ⅲα亚基[大肠杆菌OP50](ZP_06935700.1)氨基酸序列一致性为100%,EST-4与β-葡萄糖苷酶[黄曲霉NRRL3357](XP_002383240.1)氨基酸序列一致性为99%;4个差异表达基因通过调控蛋白质代谢、DNA复制和糖代谢等途径来应答镉胁迫。

萝卜DDRT-PCR技术体系的优化

【目的】探索快速高效的RNA提取方法,建立高效率的mRNA差异显示体系。【方法】以萝卜幼嫩薹叶及花蕾为材料,比较了酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿提取法（异硫氰酸胍法）与BIOZOL试剂法提取RNA的效果,并对DDRT-PCR体系中Taq酶、Mg^2＋、dNTPs、引物及cDNA用量进行了优化。【结果】BIOZOL试剂提取的RNA量大质好,经纯化后,其OD260/OD280值为1.8-2.1,表明杂质少,质量浓度大于1μg/μL,符合mRNA差异显示的要求；确定的最佳DDRT-PCR反应体系（20μL）为：10×Buffer 2.5 mmol/L,Mg^2＋2.8 mmol/L,dNTPs 0.25 mmol/L,Taq酶1.5 U,锚定引物2.5μmol/L,随机引物1.25μmol/L,cDNA用量0.5μL。mRNA差异显示结果表明,高分辨率的片断为100-1 000 bp。经验证,该体系也适用于大白菜和油菜mRNA差异显示研究。【结论】通过两种RNA提取方法比较和DDRT-PCR体系优化,获得了萝卜最佳RNA提取方法及mRNA差异显示反应体系。

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究大豆抗疫霉根腐病的分子机制

文章以中国优良大豆品种东农46及大豆疫霉优势生理小种1号菌株为材料,利用mRNA差异显示技术研究东农46与大豆疫霉根腐病菌非亲和互作中前后基因表达的差异,寻找并分离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的9条cDNA片段,通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。

水杨酸诱导的甜瓜DDRT-PCR分析及其基因差异表达片段的分离

利用DDRT-PCR技术,比较了1 mmol/L SA诱导第4天与未经SA诱导的甜瓜感白粉病品种卡拉克赛的基因表达差异.共获得差别条带19条,在SA诱导后出现差异带15条,在未诱导的对照中出现差异带4条.对其中的8条差异片段回收、克隆,用EcoRI/HindIII双酶切和PCR扩增.对其中的cDNA3-4-1测序,在BLAST上比较同源性,发现其与拟南芥热激转录因子hsf8基因具有83%的核苷酸同源性.说明1 mmol/L SA处理的甜瓜叶片在mRNA水平上发生了明显的变化,SA诱导了热激转录因子hsf8基因的大量表达,从而可能影响热激蛋白hsp70的表达,对维持蛋白质结构,稳定胞内环境具有积极作用.

DDRT-PCR技术及其在植物抗性相关基因分离克隆中的应用

介绍了DDRT-PCR技术的原理及其一般操作过程,并就近几年此技术在植物抗病相关基因(包括抗病相关基因、抗逆相关基因)的分离克隆方面的应用做了概述。同时简要介绍了此技术存在的问题及常见的解决方法,展示了其应用前景。

正交设计优化东亚砂藓DDRT-PCR反应体系

利用正交实验设计L25(56)对东亚砂藓(Racomitrium japonicum)DDRT-PCR反应体系的6因素(Mg2+、dNTP、锚定引物、随机引物、模板DNA、Taq酶)在5个水平上进行优化实验。结果筛选出各反应因素的最佳体系(20μL)为:Mg2+2.25mmol/L、dNTP0.4mmol/L、锚定引物1.0μmol/L、随机引物0.7μmol/L、模板DNA1.6μL、Taq酶2.5U。对东亚砂藓DDRT-PCR最佳反应体系进行梯度PCR引物退火温度筛选,得到的最佳退火温度为45.4℃。该优化体系的建立,为进一步进行东亚砂藓抗旱基因的筛选与克隆等一系列分子研究提供了重要参考依据。

DDRT-PCR技术在中药研究中的应用

概述了mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的基本原理。对近年来DDRT-PCR技术在中药作用机制、中药复方作用机制、中药植物生物学方面的研究现状做了综述。展望了该技术在中药研究方面的应用前景。

应用荧光DDRT-PCR初探低剂量的ECPs诱导细胞适应性反应的机理

[目的]用荧光DDRT-PCR技术寻找低剂量环境化学污染物(ECPs)过氧化氢(H_2O_2)、甲醛(FA),三氯乙烯(TCE)诱导细胞适应性反应差异表达的基因,为进一步研究低剂量的环境化学污染物(ECPs)诱导机体的生物学效应及其机理提供科学依据。[方法]依据H_2O_2、FA、TCE对细胞毒性的剂量反应关系,建立适应性反应的模型。然后用荧光DDRT-PCR寻找对照组、低剂量组、高剂量组,适应性反应组差异表达的基因,并鉴定和验证部分差异表达的基因。[结果]按照对照组、低剂量组、高剂量组、适应性反应组处理细胞后,DDRT-PCR结果显示各处理组与对照组比较:H_2O_2有60个差异条带、FA有61个,TCE有52个。选择差异比较明显的条带进行2次PCR,然后通过进一步克隆、测序、同源性比较发现一些已知基因如BCL-2、EIF3S5、NDUFS4、RPS10等。[结论]低剂量环境化学污染物诱导机体的适应性反应可能有维持细胞稳态、抗氧化系统、DNA损伤修复级激活细胞信号分子等过程的参与。

利用DDRT-PCR鉴定芸芥自交不亲和系与自交亲和系的差异表达cDNA（英文）

芸芥与芸薹属植物具有亲缘关系，也是芸薹属植物的重要育种资源。自交亲和性是芸芥的一种重要变异性状。为了探明芸芥自交亲和基因的表达器官，并分离与自交亲和性有关的WNA片段，以芸芥的一对近等基因系，自交亲和系（SC)与自交不亲和系（SI)为试材，利用差异显示RT-PCR技术分别对开花前和开花后的叶片、花药和柱头进行鉴定。结果表明，不论开花前还是开花后，芸芥自交亲和系与自交不亲和系的叶片或花药间的扩增带型是一样的，但在近等基因系的柱头间得到了差异表达条带。这证明芸芥自交亲和基因不是组成型表达，而是组织特异性表达，柱头是其唯一的表达器官。在开花前的自交亲和系中共得到了2条cDNA片段，一条小于100bp，另一条为750～1000bP，在开花后的自交亲和系中得到了1条300bp的cDNA片段。据分析这3条cDNA片段可能与芸芥的自交亲和性密切相关。在开花前的自交不亲和系中共得到了2条cDNA片段，一条为500bp，另一条为750bp，同时在开花后的自交不亲和系中得到了1条500～600bp的cDNA片段。这些cDNA片段可以用来区分芸芥的自交亲和系与自交不亲和系，还可用于克隆自交亲和基因。

DDRT-PCR技术在研究附植前胚胎基因表达中的应用

哺乳动物附植前胚胎的发育受相应基因的调控,在不同的发育阶段表达不同的差异基因,分离并克隆差异表达基因,有利于了解胚胎发育的分子机理.本文对mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)的基本原理、特点,单胚差异显示技术(SPEDDRT-PCR)在研究动物特定发育阶段表达的基因的优点,以及对不同种类动物早期胚胎在特定发育阶段表达的基因进展情况作了介绍.

利用DDRT-PCR研究丝羽乌骨鸡与AA肉鸡肝脏基因表达的差异

利用mRNA差异显示技术研究丝羽乌骨鸡(SK)与引进的快大型肉鸡品种爱拔益加肉鸡(AA)之间肝脏组织基因表达的差异。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染方法分离差异片段,利用单链构象多态性(SSCP)技术验证差异显示片段的重扩增产物成分的单一性,采用反向Northern斑点杂交技术对获得的差异显示cDNA片段进行了差异真实性的鉴定。共获得了丝羽乌骨鸡与AA肉鸡差异表达cDNA片段38条,其中26条为丝羽乌骨鸡肝脏表达,而AA肉鸡不表达;其余12条为AA肉鸡肝脏表达,而丝羽乌骨鸡不表达。该结果为进一步研究丝羽乌骨鸡特异基因的表达探索了一种可行的方法,并积累了一定的基础资料。

DDRT-PCR技术分离枇杷幼果低温诱导相关基因

采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术,分离枇杷‘早钟6号’幼果在0℃低温胁迫6h后差异表达的基因。共分离到19个差异表达的基因片段,经反向Northern杂交,得到了4个阳性的枇杷低温诱导相关基因片段(编号为CSIGE1～4-Cold Stress Induced Genes in Eriobotrya japonica1～4)。结果显示:CSIGE1只在低温处理的枇杷果实中表达,这表明该基因与低温逆境有关;CSIGE2和CSIGE3是受低温诱导的上调表达基因;而CSIGE4登录号为GT617706,未搜索到与任何基因有相似性,可能为新基因。

用DDRT-PCR技术对太谷核不育小麦基因差别表达的研究

采用DDRT-PCR技术对太谷核不育小麦的一对近等基因系进行了差别表达分析,以找出与太谷核不育基因Ta1表达有关的基因并研究其引起雄性不育的机制.共用30对随机引物进行差异显示,从展示的近1000条cD-NA片段中找出30条特异表达的cDNA片段,其中包括可育特异和不育特异,这些片段可能与Ta1基因的表达有关.

DDRT-PCR法研究小鼠耐受全氟异丁烯中毒的相关基因

目的 急性低剂量全氟异丁烯 (PFIB)染毒后的活存小鼠可对致死量PFIB产生耐受性 ,本文旨在寻找与耐受有关的基因对揭示PFIB中毒耐受机制。方法 采用静式全暴露法 3次染毒PFIB ,抽提耐受 1个致死量PFIB活存动物的肺组织tRNA ,采用DDRT- PCR方法 ,使用 3个锚定引物和 4个随机引物分别对耐受小鼠和对照小鼠肺组织总tRNA进行逆转录和PCR扩增反应 ,通过测序胶电泳和银染分析其基因表达差异 ,并对差异DNA片段进行克隆、测序。结果 耐受PFIB的小鼠与对照鼠相比 ,在基因表达上发生了明显变化。对耐受小鼠特有的 3个差异DNA片段进行克隆、测序 ,通过BLAST与Genbank中的基因比对显示 ,克隆的EST(expressedsequencetags)均与小鼠特定的基因高度同源。结论 特异基因的表达是小鼠耐受PFIB的基础 ,耐受动物特有的 3种差异表达EST对应的基因对于揭示PFIB耐受机理可能具有重要意义。

用改进的DDRT-PCR技术进行小麦穗和花药特异表达基因的分析

本研究采用改进的DDRT-PCR技术对小麦穗和花药发育的不同阶段进行了差别表达分析,以找出穗和花药的特异表达基因。用30个随机单引物进行RAPD扩增,从展示的近1000条带中找出14条差别cDNA片段,然后以cDNA为探针进行反向Northern-Blot,结果得到一条在花药内特异表达增强的阳性片段,命名为S1176450。