DEAE-Sepharose Fast Flow分离纯化刺芹侧耳木质素降解酶

[目的]为Pleurotus eryngii—Co60-7木质素降解酶的分离纯化和综合利用提供试验依据。[方法]采用DEAE—Sepharose^TM Fast Flow离子交换介质，分别考察缓冲液pH值、流速和洗脱方式等对刺芹侧耳木质素降解酶分离纯化的影响，确定了最佳分离纯化层析条件。[结果]DEAE-Sephalose^TM Fast Flow分离纯化Pleurotus eryngii-Co60-7木质素降解酶的最佳层析条件为：选择20mmol／L，pH值为5．0醋酸钠一醋酸缓冲体系，3ml／min的流速，进行分步洗脱（100、200～300和1000mmoL／L NaCl的三步洗脱），可较好地实现刺芹侧耳发酵液木质素降解酶初分，该纯化操作目标蛋白回收率达85％，纯化分离因素为2．71。[结论]该技术在分离纯化刺芹侧耳木质素降解酶上可行，具有潜在的工业应用价值。

DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析对龙牙百合多糖纯化工艺研究

采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换剂、4.6 cm×100 cm的层析柱,以多糖主峰的对称性、宽度和多糖得率为指标,筛选最佳上样量、流速和吸附时间,研究龙牙百合多糖的分离纯化工艺,探索快速、大量提纯百合多糖的方法和途径。结果表明:分离多糖工艺条件为上样量2 g、洗脱流速2 mL/min、吸附时间5 min,分离得2种多糖LLP1、LLP2,得率分别为33%、19.5%,总得率为52.5%,主峰尖锐、对称性好。

Study on Separation of Phycoerythrin by Q-Sepharose Fast Flow

[Objective] This study aimed to establish an efficient process for separation of phycoerythrin by using Q Sepharose Fast Flow resin and verity its feasibility for scale-up. [Method] Elution gradient, sample volume and flow rate were optimized to determine the optimal separation condition, under which the scale-up process was verified. [Result] The optimal condition for separation of phycoerythrin by using Q Sepharose FF resin was investigated： 30 ml of laver extract was loaded to the Q Sepharose FF column with a bed volume of 8 ml; subsequently, the column was stepwise eluted with 0-0.10-0.35-1.00 mol/L NaCI solution （pH 6.0） at a constant flow rate of 1 ml/min; the elution peak under 0.35 mol/L NaCI solution was collected, and the recovery rate and purity coefficient （A565/A280） of phycoerythrin were determined as 44.3 and 1.15, respectively. Based on the established process, 75 ml of phycoerythrin extract was loaded to the Q Sepharose FF column with a bed volume of 20 ml for separation, while no significant variation was observed in the separation result. [Conclusion] Phycoerythrin can be well separated from laver extract by using Q Sepharose FF resin and the process is feasible for scale-up.

苦荞水溶性蛋白体外吸附胆酸盐能力的研究

通过采用硫酸铵盐析法、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析法提取分离制备苦荞水溶性蛋白,并通过磷酸盐缓冲液pH值、动态层析流速的最佳选择改善分离提纯效果。同时通过体外吸附胆酸盐能力的测定证实所提取分离得到的苦荞水溶性蛋白具有一定的降血脂功能。结果发现:当磷酸盐缓冲溶液pH值为6.5、流速1.0mL/min于室温下洗脱的效果最好,得到的3个主要分离组分中峰3的体外吸附胆酸盐能力最佳。

批式吸附法制备人凝血因子Ⅸ复合物(英文)

目的 制备纯度较高 ,潜在血栓性小的凝血因子Ⅸ (FⅨ )复合物。方法 以人新鲜冰冻血浆为原料 ,采用SD病毒灭活工艺 ,经国产DEAE SepharoseFastFlow胶批式吸附和Ca3 (PO4) 2 吸附制备凝血因子Ⅸ复合物。结果 两步的活性收率分别为 ( 89.94± 1.31) % (n =7)、( 82 .2 7± 2 .18) % (n =6 ) ,制品的FⅨ∶C比活为 ( 16 .2 8± 2 .80 )IU/mg。FIX的量为 ( 12 6 .82±11.6 0 )IU/瓶 ( 2 0 0PE)。结论 本工艺实用性较高 ,可用于制备低成本 ,高质量的凝血因子Ⅸ复合物。

肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖的提取纯化及其对细胞免疫活性的影响

采用液体深层培养得肺炎克雷伯氏菌Kp 9株发酵液,研究确立了菌体快速裂解条件:NP4 0 1%和胰蛋白酶2 5 0IU g菌体,5 0℃作用1h ,然后加入溶菌酶80 μg mL ,5 6℃作用1h ;裂解液经超滤浓缩和有机溶剂沉淀获得多糖粗品;多糖粗品先后经CTAB吸附分离,DEAE SepharoseFastFlow离子交换和SephacrylS 30 0HR凝胶过滤纯化,得分子量分布相对均一的多糖纯品,产品得率为0 2 5 1g L。采用淋巴细胞转化实验分别探讨了多糖粗品和纯品的免疫活性,研究显示荚膜多糖具有高效的体外细胞免疫活性,并具有典型的双向免疫调节作用。研究结论为肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖的开发奠定了前期基础。

断体地龙促进创伤愈合活性成分筛选研究

目的:从断体地龙提取液中筛选其促进创伤愈合的活性成分。方法:采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析对断体地龙提取液进行分离纯化,通过CCK-8法测定不同洗脱液对NIH3T3细胞增殖的作用,筛选活性较强的组分。结果:离子交换层析梯度洗脱后得到5个洗脱峰。在一定浓度范围内,五种成分对NIH3T3细胞均有促进增殖作用,细胞增殖率随着蛋白浓度增大呈依赖上升趋势。当蛋白浓度为1.5μg/m L时,各组细胞增殖率均达到最大值,其中3号洗脱液作用的细胞增殖率最大。结论:断体地龙提取液经离子交换层析后得到的3号洗脱液促进NIH3T3细胞增殖作用最强,表明其可能含有促进创伤愈合的潜在活性成分,有待进一步研究。

单组分胰岛素的制备及质量分析

单峰胰岛素经DEAE 琼脂糖快流速离子交换层析后用醋酸锌结晶,得到结晶单组分胰岛素.层析和结晶的胰岛素回收率分别为93.8%±1.0%(n=3)和94.7%±1.5%(n=3).产品经PAGE分析为单带,HPLC检测高分子量杂蛋白和脱酰胺胰岛素的含量分别为0.42%±0.06%(n=3)和1.29%±0.06%(n=3),锌的残留量为0.187%±0.006%(n=3),产品效价为27.13±0.40U/mg(n=3).所有指标均达到USP24的质量标准.该工艺具有回收率高、产品质量好的特点.

不同分离提纯工艺对冬凌草多糖提取率与免疫活性的影响

目的:优选分离冬凌草多糖的方法,探究不同分离方法对冬凌草多糖分离效果的影响。方法:分别以DEAE-Sepharose Fast Flow(Cl-型)弱极性阴离子交换层析法、乙醇分级醇析法对冬凌草粗多糖进行分离纯化,以不同分离组分中多糖含量及其免疫活性比较优选冬凌草粗多糖的分离工艺。结果:DEAE-Sepharose Fast Flow(Cl-型)弱极性阴离子交换层析法分离得到5个组分,通过乙醇分级醇沉初步得到4个冬凌草多糖组分,前者分离产品纯度较高,而后者产品在体外小鼠脾淋巴T细胞的增殖实验中表现出较强生物活性。结论:为进一步研究冬凌草多糖的生物活性,可选用乙醇分级醇沉法对冬凌草多糖进行分离纯化。

大豆球蛋白的组成多肽分离及氨基酸组分分析

通过Nagano方法制备得纯度达95%以上的大豆球蛋白,以其为原料,通过制备型液相色谱,对大豆球蛋白的组成多肽进行了分离。结果显示:以DEAE-Sepharose Fast Flow为分离介质,以含有6 mol/L碳酰二胺和0.02 mol/L巯基乙醇、pH值为6.45的0.05 mol/L磷酸缓冲液为平衡液,通过对穿透液及梯度洗脱液的分部收集,大豆球蛋白的组成多肽能得到较好的分离,回收率达到75%,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示各组分的纯度达90%。此外,对各组成多肽的氨基酸组分及种类进行了分析。

Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺研究

[目的]建立Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺方法并验证其放大可行性。[方法]通过对洗脱条件、上样体积以及洗脱流速的优化,确定最佳分离工艺条件;在确定的工艺条件下,将上样体积与柱体积等比例放大。[结果]Q Sepharose FF分离藻红蛋白的最佳工艺条件为:将30 ml坛紫菜提取液加载到8 ml Q Sepharose FF柱上,以1 ml/min的流速使用添加0-0.10-0.35-1.00 mol/L NaCl的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 6.0)分步洗脱,收集0.35 mol/L NaCl溶液洗脱时的色谱峰。在此条件下R-藻红蛋白的回收率和纯度系数(A565/A280)分别为44.3和1.15。按照该工艺,将75 ml藻红蛋白提取液加载到20 ml Q Sepharose FF柱上进行分离,发现分离效果没有发生明显变化。[结论]使用Q Sepharose FF介质能够分离坛紫菜提取液中的藻红蛋白且该工艺易于放大。

关白附多糖纯化工艺优化及抑制结肠癌肝转移

目的采用Box-Behnken法优化关白附粗多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱法分离得到0.2M NaCl部位多糖ACP02的纯化工艺,为该成分的富集和后续的药效开发打下基础。方法在单因素试验基础上,以上样量、洗脱时间、洗脱流速为影响因素,总多糖含量为评价指标,Box-Behnken响应面法优化纯化工艺。以雄性BALB/C裸鼠注射HT-29单细胞悬液作为结肠癌肝转移模型,分别用多糖低剂量组(100 mg·kg^(-1 ))、多糖高剂量组(200 mg·kg^(-1 ))处理,观察老鼠体重变化,30天后处死小鼠,取出肝脏和脾脏,观察发生转移的裸鼠个体数量。结果根据响应面法得出DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱法最优工艺参数,即上样量5.03 g,洗脱时间73.10 min,洗脱流速7.33 mL·min^(-1);不同质量浓度多糖给药后,裸鼠体重无明显变化,给药组与对照组相比较发生转移的裸鼠个体数量显著性减少。结论该方法纯化ACP02方便可行、稳定可靠、预测性良好。ACP02对于体内结肠癌肿瘤肝转移有明显抑制作用。

交变电场下离子交换色谱分离过程

以牛血清白蛋白在阴离子交换剂DEAE -SepharoseFastFlow上的吸附和解吸过程为例 ,考察了交变电场下离子交换色谱过程的吸附和洗脱过程及其传质特性 .结果表明 :在本文实验条件下 ,交变电场电流强度的变化对离子交换吸附平衡无显著影响 ,而外加电场在介质孔内所产生的电渗流可加速待分离组分进出固相介质的传递过程 ,显著提高色谱填充床的动态吸附容量 。

MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体的制备、纯化及初步应用

目的制备MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,并进行纯化及初步应用,为进一步研制宿主细胞残留蛋白检测试剂盒奠定基础。方法无血清悬浮培养MDCK细胞,采用不同方法(反复冻融、裂解液、超声)裂解细胞获得全细胞蛋白抗原。将抗原与弗氏佐剂乳化后经背部多点皮下免疫家兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,当抗体效价≥1×106时,经家兔颈动脉采血,获得含多克隆抗体的血清。血清先经硫酸铵盐析粗提,再经DEAE-Sepharose Fast Flow和Protein A精纯,获得多克隆抗体,分析抗体蛋白回收率、纯度及抗原覆盖率。应用制备的多克隆抗体,Western blot法检测MDCK细胞培养流感病毒纯化工艺各阶段样品的宿主细胞残留蛋白。结果采用不同方法裂解细胞与不同离心力制备的抗原无区别,免疫家兔后,血清抗体效价最高可达320 000;纯化后的多克隆抗体纯度> 94%,DEAE-sepharose Fast Flow柱纯化效果优于Protein A柱;MDCK细胞培养流感病毒纯化初期存在较多的宿主细胞蛋白,经多步骤纯化后,单价原液中未见残留蛋白,仅含流感病毒蛋白。结论成功制备了MDCK宿主细胞残留蛋白多克隆抗体,可定性分析纯化各阶段样品的残留蛋白。