DF1细胞替代DF1细胞上清快速检测外源性禽白血病病毒的探究

本研究旨在探究用DF1细胞替代DF1细胞上清对外源性禽白血病病毒(ALV)进行快速检测。采集ALVp27抗原阳性的地方品种百日鸡的抗凝血22份,阴性鸡的抗凝血2份,离心取白细胞接种DF1细胞培养,重复9块24孔细胞培养板。每隔24h取1块24孔板,分别收集细胞上清与DF1细胞于-20℃冻存,直至第9天,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测所有细胞上清与DF1细胞中的ALVp27抗原,并采用SPSS Statistics 17.0软件比较分析细胞上清与DF1细胞中ALVp27抗原S/P值的差异性与相关性。结果显示:培养8d的细胞上清中可检测到所有的15份阳性样品,而培养4d即可在DF1细胞中检出所有阳性样品(15份);15份外源性ALV样品在细胞上清中初始检出p27抗原阳性时,同一培养时间的DF1细胞中的S/P值均明显高于细胞上清中的S/P值,差异极显著(P<0.01);培养4～5d的DF1细胞与第9天收集的细胞上清中p27抗原S/P值相关性最高,分别为0.946、0.923。本研究显示,检测培养4～5d的DF1细胞中的ALVp27抗原与经典方法所要求的检测培养9d的细胞上清中的ALVp27抗原可达到相同的效果。

禽呼肠孤病毒感染DF1细胞后干扰素刺激基因在转录水平表达量的动态变化

为了解干扰素(interferon,IFN)和干扰素刺激基因在禽呼肠孤病毒(ARV)感染DF1细胞后的表达情况,试验将ARV病毒感染DF1细胞,观察细胞病变,收集感染后0、6、12、24、36、48、72、96 h的细胞样品,抽提反转录成cDNA,通过实时荧光定量PCR技术检测干扰素IFN-α和IFN-β及9种禽源常见干扰素刺激基因在感染后不同时间点在转录水平表达量的动态变化规律。结果显示,在ARV感染DF1细胞后,DF1细胞出现典型的细胞病变,感染后12 h病毒开始快速增殖,在36~96 h维持在较高的水平;IFN-α和IFN-β在转录水平的表达量在感染后均表现为显著下调(P<0.05;P<0.01);IFI6、OAS、IFIT5、ISG12在转录水平表达量变化规律相似,均呈现显著上调表达(P<0.05;P<0.01),在感染后96 h达到峰值;其中IFIT5的上调幅度最大,感染后96 h的表达量是0 h的19.62倍(P<0.01);而Mx、IFITM3、PKR、Viperin、ZAP的表达量变化规律相似,均表现为显著下调表达(P<0.05;P<0.01),其中Mx、IFITM3、Viperin的下调幅度较大,PKR和ZAP下调幅度很小。说明在ARV感染DF1细胞后,干扰素及多种干扰素刺激基因在转录水平呈现规律性变化,与病毒在DF1细胞中复制存在一定的联系。结果表明,ARV感染后可以诱导多种干扰素刺激基因的表达,这些干扰素刺激基因在抵御ARV病毒的入侵,抑制ARV的复制、释放及病毒的清除中发挥着重要作用。本研究为今后深入研究ARV的致病机理和宿主的抗病毒免疫应答提供了参考。

应用基于重组慢病毒的CRISPR/Cas9技术构建基因突变的鸡DF1细胞

为证实基于慢病毒的CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于鸡基因组编辑,以鸡的mavs基因为靶基因,通过设计sgRNA,构建表达靶向mavs基因sgRNA的重组慢病毒,并将其感染DF1-Cas9细胞,通过T7E1酶切试验以及mavs基因的靶向序列测定,分析该方法是否可以用于鸡细胞的基因编辑。扩增sgRNA靶向序列1 220 bp片段,经T7E1酶切琼脂糖凝胶分析可见约300 bp和900 bp大小的条带,表明感染sgRNA慢病毒的细胞mavs产生了突变。序列测定结果表明sgRNA靶向序列发生了多个碱基缺失的突变。以上结果表明基于慢病毒系统的CRISPR/Cas9技术可对鸡基因组进行编辑。

3种ELISA试剂盒检测不同亚型外源性鸡白血病病毒的比较

为建立一种稳定、快速从感染鸡体内检测或分离外源性鸡白血病病毒(ALV)的简易方法,作者使用A亚型(ALV-A)、C亚型(ALV-C)以及2株J亚型(ALV-J-PY和ALV-J-WS)鸡白血病病毒(ALV)按高、中、低(即100、10、1μL)3种接种量人工接种DF1细胞,在接种后不同时间用A、B、C 3种ELISA试剂盒检测ALV抗原(P27)。结果表明,对ALV-A和ALV-J-PY,高剂量接种时,用A试剂盒在接种后第3天即可检测出;低剂量接种时,第7天可检出。使用B试剂盒,2株病毒的检出时间延长(高剂量组分别为第7天和第5天;低剂量组分别为第15天和第13天);使用C试剂盒,所需检出时间最长(接种后第13天)。对ALV-C和ALV-J-WS毒株,A试剂盒对高剂量组,分别能够在接种后第5天和第9天检出,其它中、低接种量组15 d内均没有检出;而B、C2个试剂盒对3个接种剂量组均没有检测出。从以上结果看出,3种ELISA试剂盒对3种亚型ALV毒株的检出时间存在明显不同,A试剂盒灵敏度最高,能最早作出检测;B试剂盒灵敏度次之。同时,无论使用哪种试剂盒ALVs的检出时间与病毒接种量间存在很大的相关性。本研究结果为外源性ALV的检测及病毒分离研究提供一定的科学依据。

黑加仑花色苷抗禽白血病A亚群病毒作用

研究了黑加仑花色苷(Anthocyanin from Blackcurrant,ACB)对禽白血病A亚群病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)的抑制作用。作者以ACB粉为原料,采用高效液相色谱仪与质谱仪联机(HPLC-MS)的方法鉴定了其主要活性成分,随后采用体外实验,应用MTT法和观察细胞形态法检测了ACB对鸡成纤维细胞系(DF1)的细胞毒性的影响,建立细胞模型,研究加入ACB后对ALV-A的预防和治疗作用。结果表明:ACB主要含飞燕草色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷和矢车菊色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷两种组分;ACB对DF1无细胞毒性的质量浓度为10μg/mL;基于ACB的预防和治疗实验,ACB可明显抑制ALV-A的增殖,具有良好的剂量-效应关系,因此ACB具有一定的体外抗ALV-A作用。

禽呼肠病毒在鸡胚成纤维细胞系中的增殖规律

为研究禽呼肠病毒(ARV)在鸡胚成纤维细胞(DF1)上的增殖规律,将ARV S1133株接种至DF1细胞,连续传代3次后观察细胞病变(CPE),RT-PCR检测病毒核酸。结果显示,ARV S1133株对DF1细胞有很好的亲嗜性,并出现典型的CPE。按照Reed-Meunch方法测量7个时间点的TCID50,并绘制生长曲线。结果显示,ARV感染DF1细胞后的0h^12h为静止期,12h^48h为快速增长期,并在48h达到最大的病毒效价,TCID_(50)为10^(-8.9)/0.1mL,为进一步研究ARV的致病机理,以及在DF1上研制禽呼肠病毒细胞灭活苗提供参考。

禽呼肠孤病毒σC蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析

本研究根据GenBenk中σC的序列设计特异性引物,通过PCR扩增σC基因,构建真核表达载体pEF1α-HA-σC,转染DF1细胞,在DF1细胞中表达ARVσC蛋白。结果显示,成功在DF1细胞中表达ARVσC蛋白,大小约为37 ku,Western-blot分析表明,表达的蛋白具有良好的反应原性,激光共聚焦显微镜观察发现在DF1细胞中表达的σC蛋白定位于细胞质中。本研究为今后深入研究σC蛋白在ARV感染过程中的功能和在ARV天然免疫中的具体调控机制奠定了基础。