非小细胞肺癌组织中caspase-3及其底物PARP、DFF45蛋白表达的意义

目的探讨caspase-3及其底物多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)、DNA裂解因子(DFF45)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织的表达及与临床病理的关系。方法采用第二代免疫组化Elivision法和West-ern blot法检测87例NSCLC原发灶中caspase-3、PARP、DFF45蛋白的表达。结果在87例肺癌原发灶中caspase-3、PARP、DFF453种蛋白表达阳性率分别为:66.67%,33.33%,29.88%。caspase-3和DFF45蛋白的阳性表达率与组织学类型无关(P>0.05),而与分化程度和淋巴结转移均显著相关(P<0.05);但PARP仅与淋巴结转移显著相关(P=0.014)。87例NSCLC组织中,caspase-3的表达与PARP呈显著负相关(P=0.000);caspase-3与DFF45的表达之间具有显著正相关性(P=0.020)。结论caspase-3通过降低其底物PARP的表达从而促进肿瘤细胞的凋亡,明显地抑制了肺癌的侵袭和转移。caspase-3和DFF45蛋白的低表达,通过使肺癌细胞更耐受凋亡而促进了肺癌细胞的生长和淋巴结的转移。

Caspase-3及其底物DFF45在人肺癌组织中的表达及意义

目的:检测Caspase-3、DNA裂解因子(DFF45)在肺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系。方法:在57例肺癌组织中应用免疫组织化学SP法、Westernblot检测Caspase-3、DFF45蛋白的表达。结果:Westernblot实验结果与免疫组化基本相符。57例肺癌组织中Caspase-3、DFF45蛋白表达阳性率分别为66.67%,29.82%。Caspase-3和DFF45蛋白的阳性表达率与组织学类型无关(P>0.05),与肺癌的分化程度和淋巴结转移显著相关(P<0.05)。在肺癌组织中,Caspase-3与DFF45的表达具有显著正相关性(P=0.024)。结论:Caspase-3和DFF45蛋白的低表达,促进了肺癌细胞的生长和淋巴结的转移。

Caspase-3及其底物DFF45在大肠腺癌组织中的表达和意义

目的:研究Caspase-3和DFF45在人大肠腺癌组织的表达及与临床病理特征的关系,并探讨其与大肠腺癌的侵袭和转移的关系。方法:采用免疫组织化学S-P法测定58例大肠腺癌组织中Caspase-3和DFF45的表达情况。结果:Caspase-3、DFF45在大肠腺癌中的阳性表达率分别为34.5%(20/58)、46.6%(27/58),Caspase-3、DFF45的表达与分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05),而与组织类型、Dukes分期无明显相关(P>0.05)。Caspase-3的表达与DFF45呈显著正相关(r=0.414,P=0.001)。结论:Caspase-3和DFF45蛋白的低表达促进了大肠癌细胞的生长和淋巴结的转移。

Caspase-3和DFF45在复发性结直肠癌中表达的意义

目的探讨Caspase-3和DFF45检测在复发性结直肠癌中判断预后和远处转移中的应用价值。方法采用western blot方法测定41例复发性结直肠癌组织中Caspase-3和DFF45的表达情况。结果 Caspase-3和DFF45的表达与再手术后的患者生存期有关。在患者生存期不到1 a的复发性结直肠癌组织中,Caspase-3和DFF45的表达均很低,而1～3 a和3 a以上的表达水平明显增高,以3 a以上组的表达最高。另外两者的表达与远处转移也有关,伴有远处转移者表达低,而仅局部复发者表达高。Caspase-3的表达与DFF45呈显著的正相关性。结论 Caspase-3和DFF45蛋白的表达可作为判断复发性结直肠癌预后和远处转移的指标,为术后的随访和放化疗方案的制定提供参考依据。

诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-B在宫颈癌组织中的表达及意义

目的检测诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-B(the cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector-B,CIDE-B)在人宫颈癌组织中的表达,探讨其与宫颈癌发生发展的关系。方法采用免疫组化技术检测45例宫颈癌、33例癌前病变和10例正常宫颈组织中CIDE-B的表达。结果CIDE-B蛋白在宫颈癌组织中的表达高于癌前病变及正常宫颈组织(P<0.05),CIDE-B蛋白在癌前病变组织中的表达与正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05)。CIDE-B在宫颈癌组织中的表达与临床分期、病理类型、年龄、组织类型和有无淋巴结转移均无关(P>0.05)。结论CIDE-B蛋白高表达可能与宫颈癌的发生发展有关。

大鼠肺鳞癌中DFF45和Bcl-2基因表达的研究

目的：探讨DNA裂解因子(DFF45)和凋亡抑制基因bcl-2在大鼠肺鳞癌癌变转化过程中的表达及其关系。方法：Wistar大鼠60只，其中50只用化学致癌物3-甲基胆葸(MCA)及二乙基亚硝胺(DEN)碘油溶液于左肺叶支气管灌注诱发大鼠肺鳞状细胞癌，10只作为对照。应用免疫组织化学S-P法检测DFF45和bcl-2蛋白在癌变过程中的表达。结果：对照组大鼠支气管粘膜上皮细胞区、癌前病变区与肺鳞癌区中，DFF45蛋白的阳性表达率逐渐升高，分别为20．00％(2／10)、43．75％(7／16)、58．82％(20134)，肺鳞癌区与对照组大鼠支气管粘膜上皮细胞区相比，DFF45蛋白阳性表达率的差异有显著性(P=0．0309)：bcl-2蛋白的阳性表达率分别为：0、31．25％(5116)、47．06％(16／34)，对照组大鼠支气管粘膜上皮细胞区分别与癌前病变区、肺鳞癌区比较差异均有显著性(P1=0．0495；P2=0．0065)。在大鼠肺鳞癌中，DFF45与bcl-2呈显著正相关(Pearson列联系数：0．5872，p=4．07×10^-6)。结论：bcl-2基因的过表达可能抑制了DFF45的裂解，从而使肿瘤细胞凋亡减少，增殖过多，协同促进了大鼠肺鳞癌的发生发展。

诱导细胞凋亡DFF45样效应因子C的结构与表达调控及其功能

诱导细胞凋亡DFF45样效应因子C(cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effector C,CIDEC)是近几年发现的一种脂滴结合蛋白质,属于CIDE家族成员,具有N端和C端两个结构域。该基因的组织分布具有明显的差异性,主要在脂肪组织和肝中高表达。高脂饮食和禁食等营养条件也会引起该基因表达量增高。该基因的表达受到多种因素的调控,包括多种转录因子和营养相关因子。近些年来发现,CIDEC定位于脂滴表面,调控脂滴间的融合。进一步研究发现该蛋白质与其他蛋白质(例如CIDEC,CIDEA、PLIN1)相互作用形成复合体引起接触的脂滴之间形成孔道。随后,脂质从小脂滴转运到大脂滴,进而使脂滴之间发生融合和生长。另外发现,CIDEC是促进细胞凋亡的重要蛋白质,同时在抑制脂肪分解方面具有重要作用。本文重点介绍CIDEC的结构特点,转录调控机制、亚细胞定位以及主要功能的作用机制,并对未来的研究方向提出思考,为CIDEC作用机制的有关研究提供理论基础和探索思路。

DFF45在肝细胞肝癌中的低表达及其临床意义

背景与目的:研究表明DNA裂解因子45(the DNA fragmentation factor 45,DFF45)在肿瘤细胞中表达异常与肿瘤细胞凋亡、分化、恶性表型密切相关。本研究探讨DFF45在肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)组织、癌旁肝组织、正常肝组织、3种不同的肝癌细胞株、永生化的肝细胞株LO2中的表达,并分析其与肝癌患者临床参数的相关性。方法:采用免疫组化、Western blot及RT-PCR检测35例HCC组织及相应癌旁组织、10例正常肝组织中DFF45蛋白及mRNA表达;Western blot、RT-PCR检测肝癌细胞株QGY-7701、SMMC-7721、HepG2及永生化的肝细胞株LO2中DFF45蛋白及mRNA表达。结果:免疫组化显示DFF45在HCC组织、癌旁组织、正常肝组织阳性率分别为48.6%(17/35)、77.1%(27/35)和90%(9/10),HCC组织中DFF45蛋白表达明显低于癌旁及正常组织(P<0.05)。DFF45蛋白的表达与肿瘤大小、病理分级相关。Western blot检测进一步验证了该免疫组化结果。RT-PCR结果显示,DFF45 mRNA在HCC组织中表达(0.453±0.111)同样低于癌旁组织(0.518±0.094)及正常肝组织(0.535±0.112),差异有统计学意义(P<0.05)。DFF45蛋白及mRNA在3种肝癌细胞株中表达均低于永生化的细胞株。结论:DFF45在HCC组织及肝癌细胞系中呈低表达,可能参与了肝癌的发生发展,并有可能成为肝癌治疗的新靶点。

caspase-3及其底物DFF45在肺癌组织中的表达和意义

为检测 caspase-3和 DFF45两种蛋白在人肺癌组织的表达及与临床病理特征的关系 ,在 60例人肺癌原发灶中应用免疫组织化学 S-P法检测了两种蛋白的表达。结果显示 ,在 60例肺癌原发灶中 caspase-3、DFF45蛋白表达阳性率分别为 65 .0 0 %、3 1.67%。caspase-3与淋巴结转移和组织学类型显著相关 ( P<0 .0 5 ) ,DFF45与淋巴结转移和组织学类型无关 ( P>0 .0 5 ) ;这两种蛋白表达均与肿瘤细胞分化程度无显著相关 ( P>0 .0 5 )。60例人肺癌组织中 ,caspase-3的表达与 DFF45呈显著负相关 ( P=0 .0 0 19)

人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

目的:表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45(DNA fragmentation factor 45,DFF45)融合蛋白并制备多克隆抗体。方法:构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activatedSepharoseTM4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果:成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1∶20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论:DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。

胃癌组织中caspase-3及其底物DFF45表达的意义

目的观察caspase-3及其底物DNA断裂因子(DNA fragmentation factor,DFF)45在胃癌前状态与胃癌组织中的表达,探讨caspase-3及其底物DFF45在胃癌发生中的生物学意义。方法收集胃镜活检病理石蜡标本280例,其中确诊为慢性萎缩性胃炎(CAG)89例、胃上皮内瘤变(IN)137例、胃癌54例。caspase-3及其底物DFF45蛋白表达分别采用SP法及高压修复抗原方法检测。结果 caspase-3蛋白的阳性表达率在CAG、IN、胃癌组织中分别为68.5%(61/89)、52.6%(72/137)和22.2%(12/54),以CAG最高、胃癌最低(P<0.05);在不同级别IN组织中以高级别最低(P<0.05);在CAG伴与不伴肠化生及胃癌不同分化程度组织中无明显差异(P均>0.05)。DFF45蛋白的阳性表达率在CAG、IN、胃癌组织中分别为64.0%(57/89)、51.1%(70/137)和20.4%(11/54),也以胃癌最低(P<0.05);在各个病理特征组中,caspase-3和DFF45蛋白阳性表达率相互比较差异无统计学意义(P均>0.05);二者共同阳性表达105例,共同阴性表达89例,二者的效度有一定的关联性(k=0.3838,u=9.818,P<0.05)。结论 caspase-3和DFF45蛋白在CAG、低级别IN黏膜中表达上调,而在高级别IN及胃癌组织中表达下调,其在胃黏膜损伤及癌变过程中具有重要生物学意义。

Nutlin-3a通过抑制CIDEC的表达调控小鼠脂肪功能

目的探讨小鼠双微体同源基因2(MDM2)抑制剂Nutlin-3a对小鼠脂肪脂代谢功能的影响。方法建立C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导肥胖(DIO)模型,随机分为对照组:腹腔注射DMSO,实验组:腹腔注射顺式咪唑啉类似物3a(Nutlin-3a)。实验期间进行葡萄糖耐量(GTT)以及胰岛素耐量(ITT)实验。实验结束后,分离小鼠附睾脂肪组织(eWAT)、皮下脂肪组织(iWAT)与棕色脂肪组织(BAT),对白色脂肪组织进行苏木精-伊红(HE)染色,观察脂肪细胞形态变化;RT-qPCR和Western blot检测eWAT中脂代谢相关基因表达。结果与对照组相比,给予小鼠Nutlin-3a处理,增加DIO小鼠的体质量(P<0.001);对葡萄糖耐量和胰岛素敏感性没有影响;脂肪细胞体积减小;下调白色脂肪中脂滴结合蛋白诱导细胞凋亡DFF45样效应因子C(CIDEC)的表达。结论Nutlin-3a通过下调白色脂肪组织中CIDEC的表达抑制脂滴的形成。

人CIDE3基因克隆和真核表达载体构建及促凋亡作用的研究

目的:克隆人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子3(CIDE3)全长基因,构建真核表达质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3,并检测其促凋亡作用。方法:①提取人腹部皮下白色脂肪组织的总RNA,经RT-PCR获得CIDE3全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.l(+),构建重组质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3,并进行序列测定。②用脂质体法将pcDNA3.l(+)-CIDE3转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果:①经RT-PCR扩增得到特异性717 bp的目的片段,构建的重组质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3经序列测定,结果与Genbank发表的序列完全一致。②转染Hela细胞后,经Tunel染色法检测发现,转染pcDNA3.l(+)-CIDE3后有大约25%的细胞发生了凋亡,与转染空质粒pcDNA3.l(+)(<5%)及未转染质粒的细胞相比,其凋亡细胞明显增多。结论:成功克隆了人CIDE3全长基因,构建了真核表达质粒pcDNA3.l(+)-CIDE3,并验证了CIDE3基因可诱导细胞发生凋亡的生物学作用,为进一步研究CIDE3的生物学功能奠定了坚实基础。

较高浓度神经肽Y抑制人脂肪干细胞增殖并促进其分化

目的研究不同浓度神经肽Y(NPY)对人脂肪干细胞(h ADSC)增殖及分化的影响。方法分离h ADSC,用(10^(-6)~10^(-15))mol/L NPY诱导刺激h ADSC,MTT法检测其增殖;分别用完全培养基、NPY和胰岛素处理h ADSC,油红O染色观察h ADSC的分化;Western blot法检测各组过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、诱导细胞死亡的d FF45样效应因子C(Cidec)和受体相互作用蛋白140(RIP140)的表达水平。结果 (10^(-11)~10^(-15))mol/L NPY促进h ADSC增殖,(10^(-6)~10^(-10))mol/L NPY抑制h ADSC增殖;(10^(-7)、10^(-9)、10^(-11))mol/L NPY均诱导h ADSC分化,并增加PPARγ、C/EBPα蛋白表达,同时促进白色脂肪组织特异性标志Cidec、RIP140蛋白的表达。结论较低浓度NPY促进h ADSC增殖,较高浓度NPY抑制h ADSC增殖并促进其分化。

人CIDE-3蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-3(CIDE-3)蛋白兔抗人多克隆抗体并进行鉴定。方法:将原核表达载体pET28a(+)/CIDE-3转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达CIDE-3蛋白,经Ni-NTA Agarose纯化后免疫新西兰白兔,获得人CIDE-3蛋白兔抗血清,并通过免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及免疫组织化学法对抗体进行鉴定。结果:成功地表达、纯化了人CIDE-3蛋白,与弗氏佐剂乳化后,免疫新西兰白兔,获得高效价的人CIDE-3蛋白兔抗血清,ELISA结果证实该抗体具有较高的亲和性,Western blot及免疫组织化学染色显示证实该抗体能够与人CIDE-3蛋白特异性结合,是一种细胞质蛋白。结论:获得了效价高、特异性较强的人CIDE-3蛋白兔抗血清,为进一步研究人CIDE-3奠定了实验基础。

载脂蛋白A5(ApoA5)经CIDEC负向调控人脂肪间充质干细胞(AMSC)成脂分化

目的探究载脂蛋白A5 (apolipoprotein A5,ApoA5)对人脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cell,AMSC)成脂分化的影响及其机制。方法获取中南大学湘雅二医院腹部外科手术患者皮下脂肪组织,分离人AMSC,经成脂诱导剂诱导分化,以600、1 200 ng/mL ApoA5干预细胞,作为实验组;不加ApoA5干预的细胞作为对照组。定期收获细胞,观察ApoA5对细胞内脂滴油红O吸光度、三酰甘油(triglyceride,TG)含量和成脂标志物mRNA水平的影响。收获干预至14天的细胞,通过荧光抗体标记,利用激光共聚焦实验观察ApoA5与细胞死亡的DFF45样效应因子C (cell death-inducing DNA fragmentation factor 45-like effector C,CIDEC)是否存在共定位现象。定期收获细胞,分别应用real-time PCR和Western blot观察ApoA5对CIDEC、C/EBPβ的mRNA和蛋白质水平的影响。结果在同一促分化时间段内,ApoA5干预的细胞油红O吸光度、TG含量及aP2、FAS等成脂分化标志物mRNA表达水平下降。经过激光共聚焦分析发现,在AMSC成脂分化过程中,ApoA5与CIDEC存在共定位现象。在同一促分化时间段内,ApoA5可明显下调细胞内CIDEC、C/EBPβ的mRNA和蛋白质水平。结论在成脂分化过程中ApoA5与CIDEC共存,ApoA5通过下调CIDEC可抑制AMSCs成脂分化。

细胞凋亡与DNA裂解因子研究进展

DNA裂解因子(DNA fragmentation factor,DFF)也叫CAD(caspase-activated DNase),是细胞凋亡执行和调控过程中起重要作用的蛋白质之一。DFF是由40 kDa和45 kDa两个蛋白亚基组成,分别被称为DFF40/CAD和DFF45/ICAD(inhibitor of caspase-activated Dnase),DFF45是caspases-3的底物,当凋亡信号激活caspases-3,后者识别切割位点并对复合物进行切割时,可以导致DFF45与DFF40之间的作用区域的破坏,继而使DFF40从复合物中快速游离出来而活化,被释放的DFF40形成催化性的活化的同型低聚物,降解染色体DNA。

DNA裂解因子-45在宫颈癌中的表达及与HPV感染的关系

目的探讨DFF45蛋白在宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌(CC)组织中的表达及其临床意义,分析DFF45蛋白的表达和HPV16/18感染的关系。方法用免疫组化方法检测DFF45蛋白在正常宫颈组织、CIN组织及CC组织中的表达情况。结果 DFF45在正常宫颈组织、CIN组织和宫颈癌组织中的表达呈递增趋势(χ2=18.65,P<0.01)。DFF45蛋白在CIN I中的表达低于CINⅡ-Ⅲ(P<0.01);DFF45的表达改变与临床分期及HPV感染有关(P<0.05),与年龄、组织类型、分化程度及淋巴结转移无关。结论 DFF45蛋白的表达与HPV的感染密切相关,DFF45和HPV相互协调、相互促进,促进了宫颈癌的发生和进展。DFF45蛋白具有抑制凋亡的作用,有望成为一抗癌基因治疗的作用靶点。

小鼠Cidea蛋白N端缺失异构体的鉴定和研究

Cidea蛋白调节脂肪代谢,在机体能量平衡过程中起重要作用,在转录和翻译后水平受到严格调控,但在翻译水平的调节还不清楚.通过对CIDEA基因敲除小鼠模型研究,鉴定了小鼠棕色脂肪组织内源性表达Cidea蛋白N端缺失异构体mCidea-22.定点突变等研究表明其产生机制为选择性起始翻译.并且,在异位表达时,N端缺失异构体和全长异构体的比例呈现细胞系特异性.此外,蛋白质稳定性实验表明mCidea-22半衰期很短.亚细胞定位研究显示mCidea-22是内质网和脂滴定位蛋白.为深入理解Cidea蛋白的功能和精细调节提供了新的思路和方向.

小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系的建立

用含有针对小鼠FSP27基因的siRNA慢病毒,感染小鼠前脂肪细胞系3T3-L1,建立小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系,为进一步研究该基因在脂肪细胞分化和脂肪代谢过程中的作用提供实验材料.根据小鼠FSP27基因设计双链siRNA,克隆至pSilencer2.1-U6质粒,形成含U6-siRNAbox的重组质粒.在293T细胞中检测siRNA沉默FSP27基因的效率,结果显示,siRNA可以高效地抑制外源小鼠FSP27的表达.将U6-siRNAbox重组到慢病毒载体FG12上,并将慢病毒载体与其他辅助载体用磷酸钙法转入293T细胞,包装成慢病毒.收集、浓缩、纯化病毒上清并用来感染靶细胞3T3-L1,检测感染效率和内源蛋白表达量的变化.结果显示,该siRNA可以高效地抑制内源小鼠FSP27的表达,并且siRNA插入基因组中,形成稳定表达.至此,小鼠FSP27基因沉默的前脂肪细胞系成功建立,为研究FSP27基因的功能提供了研究基础.