表达于工程菌 DH5α 中 Taq DNA 聚合酶的纯化

采用聚乙烯亚胺沉淀、ＢｉｏＲｅｘ７０离子交换、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、ＰＣＲ检测等简单方法，在３０ｈ内完成ＴａｑＤＮＡ聚合酶的基因重组质粒在工程菌ＤＨ５α中超表达酶的提取纯化及酶活标定。２０００ｍｌ发酵液可提纯３万Ｕ的ＴａｑＤＮＡ聚合酶，与国外优质产品（ｐｒｏｍｅｇａ）相比，热稳定性没有差别，扩增特异性尚需进一步探讨。

pqq基因簇在Escherichia coli DH5α中表达及对其溶磷促生的影响

为丰富植物促生菌的构建模式,本文以Escherichia coli DH5α为供试菌株,通过遗传转化,将水生拉恩氏菌(Rahnella aqautilis)HX2的pqq基因簇导入E.coli DH5α,获得DH5α(pqq)菌株,采用平板溶磷、钼锑抗比色法、HPLC法、温室盆栽等试验分析研究DH5α(pqq)菌株溶磷产酸促生作用机理。DH5α(pqq)菌株与E.coli DH5α相比,溶磷圈直径、有效磷浓度增加,溶解矿质磷的能力显著增强;有机酸代谢显著增加,以产葡萄糖酸为主。DH5α(pqq)处理与对照相比对玉米株高、茎鲜重、植株鲜重、茎干重、植株干重、全磷、土壤有效磷分别提高了5.2%、30.0%、32.5%、18.5%、7.7%、30.8%和24.0%,并呈显著性差异(P<0.05)。表明来自HX2菌株的pqq基因簇通过异源表达具有活性,能够实现对溶磷促生的遗传改造。

大肠杆菌DH5α菌株感受态制备及转化率变化研究

通过氯化钙法制备大肠杆菌DH5α菌株感受态,讨论了不同保存温度和保存时间对感受态转化率的影响。结果表明,在4℃下保存,8h达到最高转化率;在-20℃和-70℃下保存,均为48h达到最高转化率。通过氯化钙法制备的DH5α菌株感受态细胞,在-20℃条件下简单保存,20d内完全可以满足一般转化研究的要求,不需要复杂的甘油、液氮处理及超低温要求。

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的:构建人钙调素(CaM)基因表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达人CaM蛋白。方法:用PCR方法获得人钙调素基因Ⅲ(hCaMⅢcDNA),将其插入表达载体pBV220,构建重组表达质粒hCaMⅢ/pBV220,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆。结果:阳性重组子在大肠杆菌DH5α中经温度诱导可高效表达CaM蛋白,经15%SDSPAGE分析,可观察到一分子量与理论值相符(约17kD)的诱导表达条带,其表达量占菌体蛋白总量的20%。进一步分析表达产物的性质表明,CaM主要以可溶性形式表达。Westernblot结果证实,17kD的表达条带可与标准鼠抗CaMMcAb起特异反应。结论:用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人CaM,为进一步研究CaM的生物学功能及研制抗CaM单克隆抗体奠定基础。

重组大肠杆菌DH5α生长曲线的测定

为了探讨重组大肠杆菌适宜的培养时间,试验将携带质粒的重组大肠杆菌DH5α单菌落液体培养至OD600值为0.6左右,按一定比例接种于LB液体培养基中进行培养,分别在0,1.5,3,4,6,8,10,12,14,16,18,20小时时取菌液,用分光光度计测定OD600值,以培养时间为横坐标、OD600值为纵坐标作重组菌生长曲线图,同时提取质粒比较不同培养时间质粒量的变化。结果表明:重组大肠杆菌DH5α的生长经历了迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期4个时期,符合细菌生长的规律;重组大肠杆菌生长至平台期时提取质粒的量最多。

大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子工程菌DH5α的发酵工艺研究

研究大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激；因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）工程菌ＤＨ５α的发酵工艺。方法：采用发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目标蛋白的表达条件如：工程菌发酵的培养基配方、ｐＨ值、诱导时间、分批补加营养物质等进行了优化。结果：根据优化的条件，２０Ｌ罐发酵工程菌，菌体收得量可达湿重１５．６ｇ／Ｌ。目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的３０％。结论：此发酵工艺可以提高ｒｈＧ－ＣＳＦ工程菌菌体的得率和目标蛋白的表达。

间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究

采用大肠杆菌ＤＨ５α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清，建立了间接ＥＬＩＳＡ 方法。经初步测定，该方法的灵敏度为０．５ｎｇ／ｍ ｌ，比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高３ ０００倍，比银染色方法的灵敏度高１５０倍。在２０～６２０ｎｇ／ｍ ｌ范围内测定呈直线关系，直线相关系数为０．８９５。经８次重复测定，显示很好的重复性。可用于测定ｒｈＧＭ－ＣＳＦ等基因工程产品中ＤＨ５α菌体蛋白的残余量。

幽门螺杆菌M_r26000外膜蛋白编码基因在DH5α中的表达

目的 构建含幽门螺杆菌 (H .pylori)Mr2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因的重组载体并在E .coliDH5α(PREP4 )中表达。方法 用PCR从H .pylori染色体中 ,扩增Mr2 6 0 0 0外膜蛋白编码基因片段。将目的基因与pQE3 0 同时经BamHⅠ、HindⅢ双酶切、纯化、连接后 ,转化含有目的基因的重组载体。以含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌DH5α并表达。表达产物经纯化后 ,用ELISA法检测其抗原性。结果 插入的基因片段为H .pyloriMr2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因与Tomb等报道相比较 ,有 1.1%的碱基发生变异 ,1.5 1%的氨基酸残基改变 ;目的基因经表达其蛋白Mr 为 2 6× 10 3 ,可溶性表达产物占全菌总蛋白的 2 0 %以上 ;目的蛋白经Ni2 + NTA琼脂糖树脂纯化后 ,其纯度达 95 %以上 ,且该目的蛋白可被H .pylori阳性患者的血清所识别 ,具有良好的抗原性。结论 成功地克隆并表达了H .pyloriMr2 6 0 0 0的外膜蛋白编码基因 ,为H .

经基因改造大肠杆菌DH5α对裸鼠结肠癌肝转移灶的治疗效果

目的:利用"与"门(AND gate)方法对缺氧敏感的甲酸脱氢酶基因操纵子、能感知细胞密度差异的lux基因转录启动子、白喉毒素基因等基因进行构建,导入NTG诱导的减毒营养缺陷型DH5α大肠杆菌(Ecoli DH5α),注射入荷瘤鼠,观察其对结肠癌肝转移灶的作用。方法:先构建质粒,然后导入诱变后DH5α大肠杆菌,注射入10只裸鼠体内,观察其毒性。后对20只结肠癌肝转移的荷瘤鼠注射后观察疗效。结果:注射野生型DH5α大肠杆菌10只裸鼠均死亡,而注射营养缺陷型DH5α大肠杆菌只有1只死亡,与未转染质粒的营养缺陷型DH5α大肠杆菌相比,注射含质粒的营养缺陷型DH5α大肠杆菌荷瘤鼠的癌转移灶大小明显小于对照组。结论:含"与"门质粒的营养缺陷型DH5α大肠杆菌安全,对结肠癌肝转移荷瘤鼠有明显趋向性及治疗作用,可为临床治疗做一新探讨。

大肠杆菌甲基化缺陷DM1菌株与普通DH5α菌株的感受态转化率的比较

目的观察甲基化缺陷的大肠杆菌DM1菌株与普通DH5α菌株感受态转化效率的差别。方法用常规氯化钙法制备二者的感受态细胞,质粒转化后计算转化率。结果DM1菌株感受态细胞转化率为(2.2±0.3)×106CFU/μg,DH5α菌株感受态细胞转化率为(6.3±0.5)×106CFU/μg。结论成功建立一种高效制备甲基化缺陷菌株DM1感受态细胞的方法,虽然该法制备DM1感受态细胞转化效率比DH5α低2-3倍,但其能够高效满足质粒克隆实验中Dam或Dcm甲基化的限制性位点的使用要求。

增强型绿色荧光蛋白在DH5α大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从pEGFPpA-CAN克隆载体中扩增出增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP),插入到pGEM-Teasy载体中,构建pGT-EGFP重组质粒,其中的SP6启动子可用来表达EGFP蛋白。携带pGT-EGFP重组载体的DH5α大肠杆菌较普通DH5α大肠杆菌菌液略带淡绿色,在荧光显微镜下能够清晰观察该大肠杆菌的形态,带有绿色荧光。同时超声裂解携带pGT-EGFP重组载体的DH5α大肠杆菌,提取菌体总蛋白,SDS-PAGE显示EGFP蛋白是以可溶性蛋白形式存在的,分子质量大约为30kD,与其理论值大小一致。

pTAT-HA质粒载体在受体菌DH5α中的转化及鉴定

目的探索pTAT-HA质粒在受体菌DH5α中转化的方法。方法配制LB培养基,将pTAT-HA质粒转化至DH5α,培养筛选成功转化子,电泳鉴定。结果pTAT-HA质粒转化菌可在Amp+LB培养基中生长,电泳结果显示质粒大小准确无误(约3000bp)。结论pTAT-HA质粒转化成功,转化菌可冷冻保存质粒,提取的质粒可用于下游分子生物学实验。

大肠杆菌DH5α生长状态的研究

以大肠杆菌菌株DH5α为材料,测定其生长曲线及在不同浓度NaHCO3、NaCl处理下的生长状态,结果表明,大肠杆菌DH5α具有较强的生长特性,对低浓度的NaCl有一定的耐受能力,并对低浓度的NaHCO3较为敏感.

提高重组质粒转化E. coli DH5α方法的研究

研究了质粒载体和外源DNA的浓度、酶切体系的酶切时间以及酶切产物的链接时间对转化效率的影响。结果表明,当pUC19质粒载体的浓度为25ng/μL,外源基因λDNA的浓度为100ng/μL,酶切时间3h,且连接时间为14h时,构建出的重组质粒转化大肠杆菌DH5α效率最高。

His-N2蛋白体外排除抑制大肠杆菌DH5α黏附猪肠黏液蛋白的研究

以植物乳杆菌KLDS1.0320候选表面黏附蛋白NP_785232 N端前两个结构域组成的融合表达蛋白为研究对象,采用体外模拟肠道环境的方法研究其对大肠杆菌DH5α黏附猪肠黏液的排除抑制作用。对猪肠黏液进行固定,加入His-N2融合表达蛋白37℃孵育1h,再加入大肠杆菌DH5α菌悬液37℃孵育1h,洗去未黏附的菌体,之后用1%Triton?X-100进行裂解,将裂解液涂布LB琼脂平板以进行菌落计数。结果表明:pH值为6.6时,相对于缓冲液阴性对照组,His-N2蛋白对大肠杆菌DH5α黏附猪肠黏液的抑制率为(50.37±3.66)%,相对于BSA蛋白对照组的抑制率为(38.33±4.55)%;pH值为7.5时,相对于缓冲液阴性对照组,His-N2蛋白对大肠杆菌DH5α黏附猪肠黏液的抑制率为(42.18±3.44)%,相对于BSA蛋白对照组的抑制率为(34.48±3.90)%。在体外模拟条件下,由植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232 N端前两个结构域组成的His-N2蛋白能排除抑制大肠杆菌DH5α对猪肠黏液蛋白的黏附。

大肠埃希菌DH5α感受态细胞转化率变化的研究

针对本实验室保藏的E.coli DH5α,对该菌株在不同生长时期的转化效率变化情况进行测定,确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案。结果表明:在细菌的生长繁殖过程中,其转化率有很大变化;得到了E.coil DH5α菌株制备感受态细胞的最佳条件。

大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进

针对实验材料E.coli DH5α,对该菌株在不同生长时期的转化效率进行测定,确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案.结果表明:在细菌的生长繁殖过程中,其转化率有很大变化;得到了E.coli DH5α菌株制备感受态细胞的最佳条件.

乳酸在DH5α、W3110菌株中的发酵生产的研究

利用PCR技术从Lactococcus lactis基因组中获得1kb的编码L-乳酸脱氢酶的基因l-ldh,通过T4连接酶将其连接到质粒p Bluescript SK(-)。构建好的重组质粒p SK(l-ldh)分别转化Eschericbia coli DH5α、W3110,以葡萄糖为唯一碳源发酵生产DL-乳酸或L-乳酸,并检测了OD550、细胞湿重。

重组质粒对大肠杆菌 DH5_α 的转化

抗乙酰胆碱受体单克隆抗体重链可变区的基因与载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ构建的重组质粒对受体菌大肠杆菌ＤＨ５α进行了转化，并在选择培养基上筛选出转化子．

大肠杆菌DH5a菌株高效电击转化条件的优化

为探索大肠杆菌DH5a高效电击转化条件,通过对电击转化条件中细胞生长状态、DNA加入量、感受态细胞体积、电场强度、速冻和恢复时间等关键因素进行优化,筛选出大肠杆菌DH5a高效电击转化条件。结果表明:大肠杆菌在细胞生长状态OD_(600)值为0.6时制备感受态细胞,按每管50μL体积分装、-80℃乙醇速冻后,加入10 pg pUC 19质粒DNA,在20 kv·cm^(-1)电场强度、电容25μF、电阻200Ω条件下电击转化,转化后恢复培养60 min,转化效率达10~(10) cfu·μg^(-1) DNA以上水平,可满足基因文库构建、抗体库筛选等试验需求。