鹅绒委陵菜有效部位(总皂苷)的分离与抗鸭乙肝病毒(DHBV-DNA)作用

目的 本文采用大孔吸附树脂(D101型)纯化新工艺技术,对来源于西部药用植物鹅绒委陵菜Potentillaansserina L.的粗提物进行分离纯化,获得具有显著抗肝炎病毒与保肝活性的鹅绒委陵菜有效部位-总皂苷类成分。本文作者重点研究了鹅绒委陵菜有效部位总皂苷类成分体内、体外抗乙型肝炎病毒作用。方法 建立以HBV转染的人肝癌细胞系(Hep G2)2.2.15细胞系为体外模型;静脉感染鸭血清DHBVDNA呈强阳性的一日龄北京雏鸭为体内模型;分别观察2.2.15细胞含药培养基中HBsAg和HBeAg及给药治疗后鸭血清中DHBVDNA水平。结果体外实验中,8d时,各剂量组的鹅绒委陵菜有效部位对HBsAg和HBeAg均有抑制作用。中剂量鹅绒委陵菜有效部位对HBsAg和HBeAg有显著抑制作用(P<0.01)。体内实验观察,中剂量和小剂量鹅绒委陵菜有效部位对DHB-VDNA有明显抑制作用(P<0.05,P<0.01)。结论 鹅绒委陵菜有效部位对乙型肝炎病毒具有明显抑制作用,同时为鹅绒委陵菜的研究、开发奠定了良好的基础。

水芹水醇提取物在雏鸭体内对DHBV-DNA的抑制效果

目的观察水芹(Oenanthe Javanica,OJ)水醇提取物在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)-DNA 的抑制效果.方法将 DHBV 感染雏鸭随机分为高、中、低三个剂量组,分别为8,5,3g/kg 组进行药物治疗.每组5～6只,ig,2次/d×10 d;设病毒对照组(DHBV),以生理盐水(NS)代替药物,ig,2次/d×10 d.阳性药用阿昔洛韦(ACV)粉剂250 mg,ig,100mg/kg,2次/d×10 d.在感染7d 后,即用药前(TO),用药后5d(T5),用药10 d(T10)和停药后3 d(P3),自鸭腿胫静脉分别取血,分离血清,检查 DHBV-DNA 水平和肝功能.治疗结束经颈静脉放血处死动物,分别切取雏鸭肝脏,作肝病理检查.结果三批实验结果表明,水芹水醇提取物中,高剂量组对感染雏鸭无毒性,给药5,10 d 能显著降低 DHBV 感染鸭血清DHBV-DNA 水平,即 d5的测定值由1.04分别下降至0.52和0.44,抑制率分别为50.0%和50.6%;d10由0.85分别下降0.42和0.36,抑制率分别为57.7%和57.6%,与病毒对照组比较,均有显著性差异(P<0.05和 P<0.01).低剂量组对鸭血清 DHBV-DNA 也有一定疗效,并显示明显的量效关系.肝功能改善明显,给药10 d,中剂量雏鸭血中 ALT,AST,SB 含量下降率分别为44.1%,44.2%,33.3%.高剂量的下降率分别为61.0%,58.3%,64.4%.低剂量虽对肝功能有改善,但无统计显著性.肝组织病理观察证实,中、高剂量对雏鸭肝脏均有保护作用,肝细胞变性坏死均较轻,肝小叶结构基本完整.结论 OJ 在雏鸭体内有抗 DHBV 的作用,保肝效果显著.

特异光敏效应对血细胞悬液中DHBV的灭活作用

目的 观察设计的靶向光敏剂所产生的特异光化学效应对血细胞悬液中病毒的灭活作用 ,以探索新型的血液病毒灭活技术。方法 以光化学效应为基本原理 ,利用反义核酸技术设计合成与DHBV DNA特异结合的TFO P ,将其作为特异的靶向光敏剂 ,在UVA的协同下将其作用于血细胞悬液中的DHBV。通过电泳转移印迹试验、原代鸭肝细胞感染试验 ,观察TFO P与DHBV DNA的结合效应和在UVA协同下灭活DHBV的效果。结果 所设计的TFO P能与不同株DHBV DNA样本产生不同程度的特异结合 ,在剂量为 0 .1nmol/ml的TFO P和照射强度为 180 0 μW/cm2 的UVA作用下 ,血细胞悬液中DHBV的活性下降 1.9～ 5 .4Log。 结论 TFO P所产生的光化学效应能显著灭活血细胞悬液中的DHBV。

芹灵冲剂对雏鸭体内DHBV-DNA的抑制作用

目的：观察芹灵冲剂（ＱＬ） 在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ） － ＤＮＡ 的抑制效果。方法：用ＤＨＢＶ感染雏鸭进行药物治疗试验，芹灵冲剂设３ 个剂量组，疗程１０ｄ，分离血清，样品点膜，标记ＤＨＢＶ－ ＤＮＡ探针，（ 血清） 斑点杂交，放射自显影膜片斑点检测。以杂交斑点光密度值（ＯＤ 值） 进行自身和组间比较，并作鸭肝病理检查评价。结果：芹灵冲剂高剂量组（５、１０ｇ·ｋｇ－１）能降低ＤＨＢＶ感染鸭血清ＤＨＢＶ－ ＤＮＡ 水平，给药ｄ５ 和ｄ１０ 的抑制率与病毒对照组比较，均有极显著性差异（ Ｐ ＜０ ．００１） ，并呈量效关系。低剂量组（２．５ｇ·ｋｇ－１）也有一定的疗效。肝病理镜检结果证实，空白对照组鸭肝细胞的变性坏死较重，而芹灵冲剂治疗组（ 大、中剂量） 则较轻。结论：芹灵冲剂不仅对ＤＨＢＶ有明显的抑制作用，而且有保护鸭肝细胞的作用。

苯丙氨酸二肽类化合物Y101对DHBV-DNA的影响

目的探讨苯丙氨酸二肽类化合物Y101对感染鸭乙肝病毒的北京雏鸭体内外DHBV-DNA表达的影响。方法90只感染DHBV的北京雏鸭随机分为对照组、Y101剂量组和拉米夫定组,各组雏鸭于给药前(d 0)、给药5 d(d 5)、10d(d 10)及停药后3 d(P 3)经腿胫静脉取血,分离血清,斑点杂交法测定鸭血清中DHBV-DNA的含量;利用灌流法分取感染鸭乙肝病毒的北京雏鸭的原代肝细胞,采用QuickEx-tract DNA Extraction Soln 1.0提取鸭原代肝细胞Y101剂量组、拉米夫定对照组和正常对照组细胞内和细胞上清中的DHBV-DNA,用TaqMan探针实时荧光定量法检测DHBV-DNA含量,观察Y101对其抑制作用。结果 Y101对体内外DHBV-DNA都具有良好的抑制作用,体内0.05、0.025 g.kg-1剂量组抑制作用明显,体外80、60 mg.L-1剂量组抑制作用最强,DNA含量明显下降(P<0.05)。结论Y101可以有效的抑制DHBV-DNA的表达,抗病毒作用明显。

小柴胡汤并用拉米夫定抗DHBV的实验研究

目的 :通过小柴胡汤并用拉米夫定抗DHBV的作用 ,探讨中西药联合抗乙肝病毒的治疗思路及疗效差异。方法 :将药物分成联合组 (小柴胡汤合拉米夫定 )、中药组 (小柴胡汤 )、西药组 (拉米夫定 ) ,分别观察其抗DHBV的不同作用。结果 :三组药物对DHBV的抑制作用 ,依次以联合组、西药组为最强 ,但两组停药后均反跳明显 ;中药组作用也较显著 ,而作用较为持久 ,停药后无反跳。结论 :就本实验方法观察 ,小柴胡汤合拉米夫定抗DHBV优势不明显。

DHBV的检测及雏鸭感染试验的探讨

目的：建立特异、敏感、方便的鸭乙肝病毒（ＤＨＢＶ）检测方法。方法：通过免疫电镜、ＰＣＲ、组织原位杂交及ＥＬＩＳＡ等技术观察病毒的颗粒形态及表面抗原与ＤＮＡ的活性，并通过静脉途径感染一日龄麻鸭，了解动物感染实验的规律。结果：透射电镜下，ＤＨＢＶ约为４０ｎｍ大小的圆形颗粒，其包膜完整、清晰，有的颗粒还见明显的多刺状核壳体；所选用的引物，能使ＤＨＢＶ阳性样本的ＤＮＡ扩增产物电泳区有一２３２ｂｐ的条带出现；光镜下ＤＨＢＶ阳性肝组织的原位杂交片中多处呈现明显的阳性显色区，区域内主要为肝细胞结果；ＤＨＢＶ的感染性越高，雏鸭被感染的比例就高，且指标转阳的时间越短；感染潜伏期约为７～２１ｄ。结论：研究所涉及的４种检测方法均有特异、敏感的特点。

一株鸭乙型肝炎病毒DHBV全基因的克隆和序列分析

目的从本地樱桃谷鸭血清中克隆鸭乙型肝炎病毒(DHBV)DNA,并进行序列分析.方法用PCR扩增DHBV全基因,连接至T载体上,挑选克隆进行测序分析,与GenBank中16株DHBV全基因组进行同源性比较,并进行分子进化树分析.结果24-18与16株DHBV基因组比较,核苷酸同源性介于89.4%99.3%之间,各开放阅读框氨基酸同源性比较显示差异显著地方位于P区.结论24-18属于DHBV西方基因型中的一个亚型.

扶正利湿活血复方对鸭乙肝模型血清DHBV DNA的影响

目的:观察扶正利湿活血中药复方对鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的抑制作用。方法:PCR筛选先天感染DHBV的1日龄广东麻鸭,随机分为病毒对照组、拉米夫定组、扶正利湿活血复方高、低剂量组,每组7只,各组分别灌胃给药30天。在灌胃前、灌胃第10、20、30天及停药第5天分别采血,辛酸钠法提取血清DHBV DNA,采用荧光定量PCR法检测血清DHBV DNA的含量。结果:扶正利湿活血复方高剂量组在给药后的第10、20、30天时,鸭血清病毒载量均明显下降,(与D0比较,P<0.05;各时间点与病毒对照组比较,P<0.01);在停药5天后,与D0组内比较,血清病毒载量仍然显著降低(P<0.01),但与病毒对照组比较则无显著下降(P>0.05);扶正利湿活血复方低剂量组在给药后的第10、20、30天时,鸭血清病毒载量均明显下降,(与D0比较,P<0.01;各时间点与病毒对照组比较,P<0.01);在停药5天后,组内与D0比较及组间与病毒对照组比较均明显下降(P<0.05)。结论:扶正利湿活血复方可抑制DHBV DNA的复制,低剂量长期效应更为明显。

广东麻鸭DHBV全基因克隆及新读码框的发现

选取3份DHBV阳性广东麻鸭血清提取DHBVDNA,设计一对扩增DHBV全基因序列引物Q1和Q2,扩增并克隆DHBV全基因序列,测序并运用相关计算机软件及方法分析获得的全基因序列。结果表明,广东麻鸭DH-BV全长为3027bp。提交GenBank后获得的收录号分别为:AY433937、AY521226、AY521227(来自1号血清);AY392760、AY536371(分别来自2、3号血清)。AY521227的PreS/SORF出现了单碱基突变,在PreC/CORF之前发现一个新的ORF,暂命名为HORF,HORF也同时存在于GenBank中储存的另外8个DHBV全基因序列中。系统发育分析表明,广东麻鸭DHBV在分化程度上是目前储存于GenBank中的DHBV全序列中最高的。成功克隆了广东麻鸭DHBV全基因序列,序列分析为进一步研究广东麻鸭DHBV提供了有益的信息。

芒果苷对DHBV感染鸭脾细胞内cAMP,cGMP水平影响的实验研究

目的:观察芒果苷对DHBV感染鸭脾细胞内cAMP、cGMP含量的影响。方法:建立DHBV感染的鸭乙肝动物模型,模型鸭随机分为芒果苷高、中、低剂量组及模型组,同时另设正常对照组,采用ELISA法检测各组DHBV感染鸭脾细胞内cAMP及cGMP的含量。结果:DHBV感染后,鸭脾细胞内cAMP含量明显降低(P<0.05),而cGMP含量无明显变化;芒果苷各剂量均可显著增加DHBV感染鸭脾细胞内cAMP的含量(P<0.05),但对cGMP含量的影响不明显;芒果苷中、低剂量明显提高DHBV感染鸭脾细胞内cAMP/cGMP比值(P<0.05)。结论:芒果苷可以调节DHBV感染鸭脾细胞cAMP的含量及cAMP/cGMP比值,这可能是芒果苷调节DHBV感染鸭机体免疫亢进、维持机体免疫稳定及降低肝细胞炎症发生的一条途径。

DHBV诱发鸭急性肝坏死发病机理的实验研究

本文用大肠杆菌内毒素和DHBV诱发鸭急性肝坏死的动物模型,动态观察急性肝坏死后TNF、LPO、ALT、SB变化,结果发现,实验后血清TNF、LPO、ALT、SB水平明显高于实验前,肝组织病理学变化表现为,肝组织呈斑块至亚大块坏死。提示:病毒、内毒素、肿瘤坏死因子及过氧化脂质在急性肝坏死发生、发展中具有重要作用。

DHBV肝内原位复制与致病性的关系研究

目的 建立DHBsAg免疫细胞化学检测方法 ,研究DHBV肝内原位复制与致病性的关系。方法 采集不同感染状态肝组织标本共 2 2份 ,分别进行DHBsAg免疫组化、Southernblot及组织病理学观察。结果 DHBsAg主要表达于肝细胞胞浆内 ,多呈弥漫性分布 ,无明显胞浆内包涵体形成。急性感染组病毒复制高峰期阳性细胞仅为 2 4 %～ 5 8% ,慢性感染组可 >95 % ;Southern杂交检测急性感染组DHBVDNA为 8.0 5± 2 .72 ,慢性感染组为 18.88± 3.86 (P <0 .0 5 )。不同感染组肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润均不明显 ,血清ALT、AST无显著变化。结论 DHBsAg免疫细胞化学方法的建立在细胞水平实现了对病毒表达抗原的定位观察。此外 ,嗜肝病毒的复制不是引起肝细胞损伤的直接原因。

荧光定量PCR观察鸭胚肝细胞培养上清DHBV载量的动态变化

通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)观察后天感染和先天感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的鸭胚肝细胞培养上清中DHBV载量的动态变化,探讨适宜于抗HBV药物的体外实验、HBV生物学特性及乙型肝炎发病机制研究的鸭胚肝细胞模型。筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚并进行肝细胞原代培养,对DHBV阴性鸭胚肝细胞原代培养,并以不同浓度的DHBV强阳性血清感染细胞。于细胞接种后不同时间点收集培养上清,FQ-PCR检测分析培养上清DHBV DNA的含量。结果显示:先天感染的鸭胚肝细胞接种第2 d上清中DHBV载量最高,第3 d大幅下降,然后缓慢上升,第8 d达到高峰,至第15 d时仍然与高峰时接近,DHBV载量的数量级都在108cop ies/mL没有变化;后天感染不同浓度的DHBV阳性血清的鸭胚肝细胞培养上清中的DHBV载量动态变化趋势基本一致,DHBV感染后第3 d大幅下降,以后逐渐上升,至第11 d达高峰,第15 d又略有下降。结论:先天感染DHBV的鸭胚肝细胞的培养上清病毒载量上升至峰值时间短,病毒载量稳定,更适合于抗HBV药物的体外实验研究。

DHBV DNA在鸭胰脾组织中原位杂交的研究

目的：对慢性DHBV感染鸭的肝、胰、脾组织 DHBV DNA作对比研究。方法：采用原位杂交技术。结果：DHBV不仅可以感染鸭肝细胞，且可感染胰、脾组织，DHBV DNA 阳性细胞的分布密度以肝组织最高，胰脾次之。结论：DHBV具有组织器官泛嗜性，但其在肝外组织中的复制似不及在肝细胞中活跃。

靶向光敏剂对细胞内DHBV的特异灭活作用

为观察特异光敏剂对红细胞悬液中细胞内DHBV的抑制作用,探索全血病毒灭活方法。将设计、合成末端标记光敏剂的三螺旋结构寡核苷酸序列(TFO-P),以适当剂量加入模拟的病毒污染血液,在UVA(长波紫外线)的协同下处理血液;以PCR技术检测细胞培养的上清液中的DHBV-DNA,以组织原位杂交技术检测原代细胞内的DHBV,观察被处理前后肝原代细胞内DHBV的活性。结果,在经0.1nmol/ml TFO-P和1800μW/cm^2UVA照射10min后,分离、培养的鸭肝细胞上清液内检不出DHBV-DNA,细胞内DHBV-DNA在第7日转阴,而对照组的培养液和细胞内均可检出DHBV-DNA。结论,试验所设计的特异光敏剂能有效抑制血细胞悬液中细胞内的DHBV。

水芹水提物在鸭原代肝细胞培养中对DHBV抑制作用的初步研究

目的：应用鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）体外肝细胞培养模型，研究中草药水芹（ＳＱ）抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的作用。方法：制取北京雏鸭原代肝细胞（５０万／ｍｌ／孔／２４孔板）于３７℃，ＣＯ２培养２４ｈ存活后，除对照组外，给药组每天换药１次，连续加药５ｄ并测定ＤＮＡ的含量。结果：①在肝细胞毒性实验中，ＳＱ对鸭肝细胞无毒性，半数有毒浓度（ＣＤ５０）大于１００００μｇ·ｍｌ－１。②在ＤＨＢＶ感染鸭的原代肝细胞培养中能够保护肝细胞，连续给药培养７ｄ，肝细胞的贴壁状态、形态和存活量均优于对照组。③对ＤＨＢＶＤＮＡ有明显的抑制作用，其抑制率（２５００μｇ·ｍｌ－１）为６４％，半数有效浓度（ＥＤ５０）为１１２０．８μｇ·ｍｌ－１，选择指数（ＳＩ）大于９。结论：实验结果提示，ＳＱ对ＤＨＢＶ有一定的抑制作用。

芹灵冲剂对雏鸭体内DHBV-DNA的抑制作用

目的观察芹灵冲剂（ＱｉｎｌｉｎｇＣｈｏｎｇｊｉ，ＱＬ）对鸭体内鸭乙型肝炎病毒（ＤＨＢＶ）－ＤＮＡ的抑制效果方法待ＤＨＢＶ感染雏鸭７ｄ血清检测为阳性后，随机分组进行药物治疗试验，每组５只，ＱＬ分为高、中、低３个剂量组，分别为１０，５和２．５ｇ／ｋｇ组，ｉｇ，２次／ｄ，１０ｄ设病毒对照组（ＤＨ－ＢＶ），以生理盐水代替药物，ｉｇ，Ｂｉｄｘ１０．阳性药用无环鸟昔（ＡＣＶ）粉剂（２５ｍｇ／支），ｉｇ１００ｍｇ／ｋｇ，２次／ｄ，１０ｄ（Ｂｉｄｘ１０）在感染后７ｄ即用药前（Ｔ０），用药５ｄ（Ｔ５），用药１０ｄ（Ｔ１０）和停药后３ｄ（Ｐ３），自鸭腿经静脉取血，分离血清，－７０℃保存待检。结果ＱＬ（５，１０ｇ／ｋｇ）组，对雏鸭无毒性，给药５ｄ（Ｔ）和１０ｄ（Ｔ１０）能显著降低ＤＨＢＶ感染鸭血清中ＤＨＢＶ－ＤＮＡ的水平，其抑制率分别与病毒对照组比较，均有显著性差异（Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．０１）；低剂量组（２．５ｇ／ｋｇ）对鸭血清ＤＨＢＶ－ＤＮＡ也有一定的疗效３批实验结果一致，并有明显的量效关系结论ＱＬ体内有抗ＤＨＢＶ的作用，值得临床进一步研究．

鸭乙型肝炎动物模型的建立和DHBV在肝脏的定位研究

本文利用ＤＨＢＶ阳性血清感染１日龄雏鸭，感染后２、４、８周以血清斑点杂交和Ｄｏｔ－ＥＩＡ检测鸭血清中的ＤＨＢＶ－ＤＮＡ和ＤＨＢｓＡｇ，其阳性率分别为５６．３％、６５．６％、７４．２％和５３．１％、７１．９％、７０．９％。进一步采用原位杂交和免疫组化对鸭肝组织内ＤＨＢＶ－ＤＮＡ和ＤＨＢｓＡｇ进行检测，结果表明ＤＨＢＶ－ＤＮＡ主要存在于细胞浆中，而ＤＨＢｓＡｇ主要分布于细胞浆及细胞膜。对肝组织的病理检查及胶原纤维特殊检测发现，ＤＨＢＶ阳性组与阴性组无明显差别。

鸭肝组织中DHBV cccDNA的实时荧光定量PCR方法的建立

目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X＋48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid genome.DHBV cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.