DNA池结合DHPLC和直接测序技术在江豚SNPs检测中的应用

选取江豚基因组中的2个已知单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位点，通过PCR扩增，将PCR产物按基因频率不同制备成0～50％的11个DNA池（DNAp001），用于变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）和直接测序分析，以探讨DNA池中基因频率的最低要求。结果显示，当稀有等位基因的基因频率不少于5％时可在DHPLC检测过程中明显分辨；而利用DNA池进行直接测序时的基因频率则需达到10％。这提示，为保证DHPLC分析的准确性和可靠性，制备DNA池时等摩尔DNA混合的个体数最好不超过10个。DNA池结合DHPLC技术的高效性与准确性可在大规模的SNPs位点筛选中发挥作用。

乳及乳制品中阪崎肠杆菌PCR-DHPLC检测新技术的建立

为了应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中阪崎肠杆菌的快速检测方法,根据阪崎肠杆菌16S-23S rRNA特异基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以阪崎肠杆菌等59株参考菌株做特异性试验;阪崎肠杆菌菌株稀释成不同梯度,做灵敏度试验,结果表明该方法具有很好的特异性,方法灵敏度较高,检测低限可达到为25 CFU/mL;该方法可以快速、准确检测阪崎肠杆菌,是食品中致病菌快速检测的新技术。

单核细胞增生李斯特氏菌PCR-DHPLC检测新技术的建立

应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌fimY的快速检测方法。根据单核细胞增生李斯特氏菌prfA和hlyA基因序列的特点设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以单核细胞增生李斯特氏菌等61株参考菌株做特异性试验;单核细胞增生李斯特氏菌菌株稀释成不同梯度,进行灵敏度试验。试验结果表明该方法具有很好的特异性,灵敏度较高,检测低限可达到为181CFU/ml。可以快速、准确检测单核细胞增生李斯特氏菌,是食品中致病菌快速检测的新技术。

DHPLC系统工作原理及其应用

变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高通量筛选DNA序列变异的新技术,从该仪器设备的组成、工作原理、基本操作方法、主要技术特点等作一综述,并对其在基因组领域的应用如SNP分析、双链DNA片段分析、微卫星分析、mRNA定量分析、引物纯度检测等方面及在医学、遗传学方面的应用作了较详细的综述。

DHPLC检测胃癌微卫星不稳定性

为探讨一种快速、简便、可靠的胃癌微卫星不稳定性(MSI)检测方法,用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 银染法检测28例胃癌12个微卫星位点(D1S548、D1S552、D5S346、TP53、IGFⅡR(G)8、IGFⅡR(CT)5、TGFβRⅡ(GT)3、TGFβRⅡ(A)10、hMSH3(A)8、hMSH6(G)8、BAX(G)8和Bat26),DHPLC柱温50℃检测Bat26位点。凝胶电泳发现MSI H2例(7 14%),MSI L胃癌15例(53 6%),Bat26+2例均为MSI H,Bat26改变和MSI H表型一致(P<0 01,Fisher's确切概率法)。DHPLC亦证实2例Bat26+胃癌,结果和凝胶电泳完全一致。结果表明,DHPLC检测Bat26位点是研究胃癌MSI H的较好方法,有一定的临床应用价值。

DHPLC对猪肌肉组织差异表达EST的鉴定

采用DHPLC系统和LabWork4 0图像分析软件 ,对大白猪和广东地方品种蓝塘猪眼肌组织差异显示EST进行鉴定 ,两种方法均证实了差异显示条带的真实性。结果表明 :用DHPLC系统能够准确而简捷的检测不同组织中mRNA表达的差异 ,是 1种鉴定基因表达差异的有效方法 ,在研究基因表达 。

食品中3种致病李氏菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

应用复合PCR(multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的快速高通量检测方法。根据单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异基因序列分别设计引物,MPCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以94株参考菌株做特异性实验,并开展了重现性检测实验。MPCR-DHPLC方法同步检测到单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌的特异性阳性吸收峰,未检测到李斯特菌属其他近源种和非近源种参考菌株的阳性吸收峰,且重现性良好。该方法具有很好的特异性,可以快速、准确、高通量地检测食品中单核细胞增生李斯特菌、绵羊李斯特菌和英诺克李斯特菌,是食品微生物快速检测的新技术。

PCR-DHPLC技术快速检测食品中英诺克李斯特氏菌

应用PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立食品中英诺克李斯特氏菌的快速检测方法.根据英诺克李斯特氏菌的特有基因设计特异性引物,PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以41株参考菌株做特异性试验.试验结果表明该方法具有很好的特异性,经PCR-DHPLC可检测食品中英诺克李斯特氏菌.该方法可以快速、准确检测英诺克李斯特氏菌,是食品微生物快速检测的新技术.

应用DHPLC筛查人类mtDNA高变区I的异质性

[目的]检测人类mtDNA HVI区的异质性,建立有效的筛查低水平异质性DNA的技术。[方法]扩增人mtDNA 的 HVI区内269 bp的片段,以不同比例混合相差一个碱基的2种DNA片段的PCR扩增产物,配制异质性DNA模型,用变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测,确定最佳检测条件。[结果]应用DHPLC检测HVI区的片段(269 bp),最低可检测出含量为5％的异质性样本。在80例无关个体的mtDNA样本中,共检测到15例具有异质性。[结论]所建立的PCR-DHPLC方法可用于检测mtDNA的异质性。

DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中的应用(附12例报告)

目的探讨DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)分子诊断中的应用。方法提取12个X-ALD家系及成员的外周血基因组DNA,分15个片段扩增ABCD1基因的10个外显子,应用DHPLC技术对其进行突变筛查,并对出现异常洗脱峰的PCR产物进行DNA序列测定,证实突变位点的存在。结果12个X-ALD家系存在12种不同的ABCD1基因突变,包括8个错义突变、2个移码突变和2个无义突变,即P534R、G343V、R259W、A141T、R401Q、K276E、Y174C、A314P、fs E471、fs A247、S108X和Q177X。结论DHPLC筛查结合DNA序列测定能快速有效检测出ABCD1基因突变。不同的X-ALD家系有不同的ABCD1基因突变位点,突变类型和表型之间无特殊相关关系。

DHPLC与ABI377系统的微卫星检测效果比较

利用猪SCAU-LL资源群,根据猪USDA-MARC2.0连锁图谱,选取4号染色体上微卫星标记SW 1678,用变性高效液相色谱(DHPLC)系统和AB I377系统分析了F2代64个个体的微卫星多态性,比较了这2个分析系统在进行微卫星分型中的效率和利弊.2个系统检测到57个样品的基因型相同,有相同的2个样品未检测到产物.另外有3个样品,DHPLC检测出基因型,AB I377未检测到,有2个样品AB I377检测出基因型,而DHPLC未检测到.2个系统检测微卫星多态性的相同率达92.2%,DHPLC未检出率6.3%,AB I377未检出率7.8%,2个系统检测的灵敏度和准确度基本接近,但是DHPLC的检测成本低于AB I377的检测成本.

PCR-DHPLC技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌

本研究成功建立了玉米细菌性枯萎病菌的PCR检测方法。该方法根据细菌ITS序列的特异性,设计了对玉米细菌性枯萎病菌具有稳定性点突变的特异性引物及探针,并对5株玉米细菌性枯萎病菌及18种植物原性细菌的DNA进行了PCR、实时荧光PCR及PCR结合变性高效液相色谱技术(PCR-DH-PLC)检测。结果表明,几种方法特异性强,检测灵敏度均为菌液浓度102cfu/mL,PCR-DHPLC技术具有检测成本较低、高通量、自动化程度高、污染风险小及鉴定结果准确等特点,能够满足快速、准确诊断玉米细菌性枯萎病菌的要求。

DHPLC检测人体线粒体DNA异质性研究

目的建立筛选线粒体DNA异质性的DHPLC方法;检测线粒体DNA高变区的异质性频率。方法选取尸体18例,分别提取血、心、肝、脾、肺、肾、胰腺、脑、肌肉、皮肤、肋骨、指甲及毛发的mtDNA,用DHPLC筛选异质型样本,并用直接测序法进行验证。结果9例个体存在异质性,肌肉组织出现的异质性频率最高。结论正确认识线粒体DNA异质性对于法医学应用领域具有指导意义。

NDM-1基因DHPLC快速检测体系的建立

NDM-1基因是一种专属于"超级细菌"的重要特有的耐药基因,在食品潜在污染病原微生物的检测中着重要的作用。本研究以实现食品中超级细菌的快速检测为目标,初步建立了NDM-1基因的PCR-DHPLC快速检测鉴定方法,根据NDM-1基因序列,设计、合成了PCR引物(ND-D-F和ND-D-R),并分别对NDM-1质粒DNA及其他11个标准菌株进行了PCR扩增和DHPLC检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA经过PCR-DHPLC反应扩增出特异性样品吸收峰,而其他对照菌均未出现相应吸收峰,提示本文中设计和应用的PCR引物具有NDM-1基因检测的特异性;灵敏度测定结果显示,此体系检测下限可达100fg/μL,提示PCR-DHPLC方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。

乳粉中普通变形杆菌和奇异变形杆菌复合PCR-DHPLC检测技术的建立

应用复合PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术,建立乳粉中普通变形杆菌和奇异变形杆菌的高通量检测方法。根据普通变形杆菌的blaA和blaB基因及奇异变形杆菌的ureR基因序列分别设计特异性引物,复合PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测,并以37株参考菌株做特异性试验。试验结果表明,该方法具有很好的特异性,经复合PCR-DHPLC可同时检测乳粉中普通变形杆菌和奇异变形杆菌。该方法可以快速、准确、高通量检测普通变形杆菌和奇异变形杆菌,是乳粉中致病菌高通量检测的新技术。

鹅细小病毒PCR-DHPLC检测方法的建立

为建立一种敏感、自动化,高通量的检测病料中鹅细小病毒(GPV)的PCR-DHPLC检测方法,本研究首先根据GenBank上GPV标准毒株VP3基因序列设计一对引物,建立检测GPV的PCR方法,然后将PCR检测方法与DHPLC法进行有机结合,建立了GPV PCR-DHPLC检测方法。以GPV、鹅副粘病毒、鸭瘟病毒及正常番鸭胚尿囊液进行特异性试验,结果无交叉反应,表明该检测方法具有较高的特异性。对GPV阳性样品检测结果表明该方法的敏感性较高,是常规PCR电泳法的100倍,且具有较好的重复性。对临床上采集的100份疑似病料,分别应用PCR电泳法和本试验建立的PCR-DHPLC方法进行检测,结果阳性符合率为100%。表明该方法具有特异、敏感、快速、重复性好、可高通量检测等优点,可用于临床样品的大批量检测。

脑血管狭窄患者Nf1全基因的DHPLC分析(附5例报告)

目的探讨脑血管狭窄患者Nf1基因的突变热点及突变方式。方法从全血中提取DNA,采用变性高效液相色谱分析(DHPLC)对5例脑血管狭窄病例进行Nf1全基因突变筛查;对DHPLC检测有差异洗脱峰型的区域进行测序分析。结果 5例无危险因素的脑血管狭窄患者Nf1全基因筛查发现:(1)1例出现5号外显子无义突变位点,c.541C-T;(2)5例均有14号和15号外显子之间内含子的基因突变;(3)4例有7号外显子c.702G-A的同义突变位点;(4)1例出现32号(c.4177G-A,Val-Ile)和46号外显子(c.6918T-G,Asn-Lys)的错义突变。结论在目前无其他基础疾病的脑血管狭窄患者体内的Nf1基因并非以稳定野生型存在,而是具有不同类型的突变,这些突变集中在第5、7、14、32和46等外显子上。

筛查未知SNPs的变性高效液相色谱(DHPLC)技术

本文介绍了 DHPL C技术的基本原理 ,主要应用领域 ,实验技术特点和操作的注意事项。指出 DHPL C是快速、准确、高效筛查基因未知 SNPs的工具 ,优于测序等分子生物学方法 ,在功能基因组学。

小鹅瘟病毒和鹅沙门氏菌PCR-DHPLC检测方法

小鹅瘟和沙门氏菌感染是严重危害养鹅业发展的常见病,为了快速、准确地对小鹅瘟、鹅沙门氏菌感染进行诊断,减少这两种病的危害,本试验将这两种病原体的PCR-DHPLC检测方法结合起来,建立一种可以同时检测小鹅瘟和鹅沙门氏菌的方法,并进行了初步应用。结果表明这种新的PCR-DHPLC方法稳定、敏感、特异性强,适合专业检测使用。

DHPLC及其在植物检疫工作中的应用前景

本文介绍了变性高效液相色谱(DHPLC)技术的基本原理及影响因素,并结合植物病原鉴定技术的特点,分析了DHPLC技术在植物检疫工作中的应用前景,证明了DHPLC技术将成为一种快速、准确、高效的新型植物病原检测技术。