Dkk1在胃癌诊断、治疗及预后中的应用

胃癌(gastric cancer,GC)是一种高侵袭性和高致死性的恶性肿瘤,是第五大常见癌症和第四大癌症死亡的主要原因^([1])。根治性手术是可手术GC患者的主要治疗方法,早期GC患者若及时治疗5年生存率可达90%以上[2-3]。但由于许多GC患者早期症状不典型,在诊治过程中常与胃炎或胃溃疡相混淆,导致大多数患者在首次诊断时通常已处于中晚期阶段,失去了最佳治疗时机,直接影响GC患者的预后。因此,早发现、早诊断、早治疗是降低GC高发病率和高死亡率的重要手段。

阻断DKK1通过促进CD4^(+)T细胞Th1型极化改善抗肿瘤免疫应答

目的:探讨恶性肿瘤中Dickkopf-1(DKK1)表达对CD4^(+)T细胞极化的影响及其作为肿瘤免疫治疗靶点的潜在价值。方法:利用生物信息学方法分析DKK1在多种类型肿瘤组织和癌旁组织中的表达水平,分析DKK1表达与肿瘤患者预后及肿瘤微环境免疫浸润间的相关性。利用流式细胞术检测DKK1蛋白对CD4^(+)T细胞表型变化的影响。构建黑色素瘤B16F10细胞小鼠皮下移植瘤模型,观察阻断DKK1对小鼠移植瘤生长和移植瘤组织中免疫细胞浸润与表型的影响。结果:DKK1 mRNA表达水平在多种肿瘤组织中显著高于癌旁组织,DKK1高表达与多数肿瘤患者的不良预后相关且在多数肿瘤中DKK1对CD4^(+)T细胞抗肿瘤免疫应答功能有重要负性调节作用(P<0.05或P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,DKK1蛋白刺激可显著降低CD4^(+)T细胞中T-bet、IFN-γ及CD107a表达水平(均P<0.01)。在小鼠皮下黑色素瘤模型中发现,阻断DKK1可以显著抑制小鼠移植瘤的生长(P<0.01),有效改善抗肿瘤免疫应答,表现为Th1细胞(T-bet+CD4^(+))占比显著升高(P<0.001),效应性CD8^(+)T细胞(CD44+CD62L-)占比显著升高(P<0.01),Th2细胞(GATA3^(+)CD4^(+))与Treg细胞占比显著下降(均P<0.01)。结论:阻断DKK1可有效促进CD4^(+)T细胞向Th1型极化,DKK1具有作为肿瘤免疫治疗靶点的潜在价值。

LncRNA TERC调控H3K27me3、DKK1在地塞米松干预间充质干细胞成骨细胞分化中的相关研究

目的 研究地塞米松干预骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨分化后,过表达LncRNA TERC对组蛋白H3K27三甲基化(H3K27me3)及DKK1表达的影响,从而进一步验证其对成骨分化的作用。方法 (1)地塞米松干预BMSCs成骨分化,实验分为对照组(单纯成骨诱导组)及干预组(地塞米松干预成骨组),第14天使用茜素红染色检测的成骨分化能力,RT-PCR检测第3、7、14、21 d各组细胞中BMP-2、SMAD-1、Dlx5、Dlx3等成骨相关基因的表达。(2)地塞米松干预BMSCs成骨分化,构建TERC过表达载体,分别设置:空白对照组(地塞米松干预成骨组)、空白载体组、TERC过表达组。RT-PCR检测第3、7、14、21 d各组细胞中BMP-2、SMAD-1、Dlx5、Dlx3等成骨相关基因的表达,Western blot实验检测各组细胞中H3K27me3、DKK1的蛋白水平。结果 (1)地塞米松干预BMSCs成骨分化后,茜素红染色显示其成骨能力下降(P均<0.05),且RT-PCR显示,随着地塞米松干预时间的延长,BMP-2、SMAD-1、Dlx5、Dlx3等成骨相关基因均下调(P均<0.05)。(2)TERC过表达转染实验中,TERC过表达组细胞中BMP-2、SMAD-1、Dlx5、Dlx3等成骨相关基因与其他两组比较均上调(P均<0.05),其他两组以上成骨基因表达水平比较,差异无统计学意义(P均>0.05);TERC过表达组细胞中H3K27me3的蛋白表达水平较其他两组显著上升(P均<0.05),DKK1的蛋白水平较其他两组显著下降(P均<0.05)。其他两组中以上基因蛋白表达水平相近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 过表达LncRNA TERC能够显著调高地塞米松干预BMSCs向成骨细胞分化能力,并与H3K27me3及DKK1在地塞米松干预BMSCs向成骨细胞分化中存在有相关性。

血清DKK1在肝细胞癌诊疗中的应用研究进展

肝细胞癌(HCC)是临床常见的恶性肿瘤,正确的早期诊断、科学的疗效判断在HCC癌的诊治中具有重要作用。近年来越来越多的研究证实,分泌性蛋白DKK1与HCC发生发展密切相关。血清DKK1作为一种简单易行的检测方法,在HCC诊疗中的应用价值日趋凸显。本文近年来国内外关于使用血清DKK1进行HCC诊断和鉴别诊断、病情评估和判断、治疗疗效分析等三方面的研究文献进行系统整理,供同行参考借鉴。

云克对类风湿关节炎患者骨代谢及Wnt/DKK1相关因子表达研究

目的:观察云克对类风湿关节炎患者炎症介导骨代谢的治疗效果及安全性,以及对Wnt/DKK1信号通路相关蛋白的影响。方法:选取2020年11月至2021年12月就诊于贵州中医药大学第二附属医院风湿免疫科的60例类风湿关节炎患者为研究对象,按照随机数字表法分为治疗组和对照组,每组30例。对照组给予甲氨蝶呤片联合来氟米特片口服治疗,治疗组在对照组基础上加锝(99Tc)亚甲基二膦酸盐注射液(商品名:云克)治疗。治疗前及治疗后第3个月、第6个月、第12个月检测骨密度,以观察骨密度变化百分比;治疗前、治疗后第12周检测Wnt/β-catenin相关因子[β-连环蛋白(β-catenin)、Dickkopf-1相关蛋白(DKK1)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(lLRP6)],细胞因子[白细胞介素(IL)-17、IL-6],骨代谢标志物[β-CTX、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tTRAP5b)]水平。结果:①治疗组ESR、DAS28-ESR评分、CRP、HAQ、VAS评分,在第4周至第12周均下降,且与对照组相比下降更为明显(P<0.05)。②治疗12周后,治疗组骨破坏标志物、炎症因子、Wnt信号通路抑制因子DKK1血清水平均较对照组低(P<0.05),治疗组Wnt通路活化因子β-catenin、LRP6较对照组血清含量高(P<0.05)。③治疗后,2组脊柱及髋部骨密度变化百分比比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。2组髋部及脊柱骨密度变化百分比均在第12个月与第3个月比较增长明显(P<0.05)。结论:云克可以改善类风湿关节炎患者临床症状,降低疾病活动度,调节骨代谢,可能通过Wnt/DKK1信号通路介导类风湿关节炎患者骨破坏进展,且安全性较好。

CLEC1B、DKK1、DRD4在原发性肝癌病变组织中的表达及临床意义探究

目的分析C型凝集素结构域家族1成员B(C-type lectin domain family 1 member B,CLEC1B)、分泌型蛋白Dickkopf 1(DKK1)、多巴胺受体D4(dopamine receptor D4,DRD4)在原发性肝癌(primary hepatic cancer,PHC)患者病变组织中的表达及临床意义。方法回顾性选取2022年1月~2023年1月在四川大学华西医院接受肝癌切除术且经术后病理证实为PHC的138例患者,取其癌组织与癌旁组织石蜡病理标本,分析其CLEC1B、DKK1、DRD4表达情况及和临床病理特征关联性,Pearson法分析CLEC1B、DKK1、DRD4的相关性。结果肝癌组织中CLEC1B、DRD4表达水平均低于癌旁肝组织,肝癌组织中的DKK1蛋白表达较癌旁肝组织更高(P<0.05),且3者均主要分布于细胞浆;CLEC1B低表达、DKK1高表达、DRD4低表达分别97例(70.29%)、91例(65.94%)、78例(56.52%),PHC患者的CLEC1B低表达与术前AFP水平、血管侵犯、远处转移、肿瘤出血等密切相关(P<0.05),DKK1高表达与术前AFP水平、BCLC Kinki分期、肿瘤数目、肿瘤大小密切相关(P<0.05),DRD4低表达与术前AFP水平、肿瘤数目、肿瘤大小、卫星结节、血管侵犯密切相关(P<0.05);Pearson相关分析显示,PHC患者CLEC1B、DRD4与DKK1表达水平呈负相关(r=-0.809、r=-0.774,P<0.001),CLEC1B与DRD4表达水平呈正相关(r=0.748,P<0.001)。结论CLEC1B、DRD4在PHC患者癌变组织中呈低表达,而DKK1呈高表达,且与临床病理参数有关,CLEC1B、DKK1、DRD4可能参与PHC发生发展,有一定检测意义。

血清β2-MG、Cys-C、DKK1联合检测对多发性骨髓瘤患者预后的预测价值

目的:分析多发性骨髓瘤患者血清β2-微球蛋白(β2-MG)、膀抑素C(Cys-C)、Dickkopf-1(DKK1)表达水平及对其预后的预测价值。方法:选取郑州市金水区总医院2019年6月—2023年6月收治的多发性骨髓瘤患者101例为研究组,另选取同期健康体检者76例为对照组。比较2组入院时血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平;分析血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平与多发性骨髓瘤患者Durie Salmon(D-S)分期、ISS分期的相关性;分析血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平联合检测对多发性骨髓瘤患者预后的预测价值。结果:入院时,研究组血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平分别为(8.31±0.81)mg/L、(1.71±0.31)mg/L、(8.61±1.86)ng/L,高于对照组的(1.53±0.57)mg/L、(0.72±0.17)mg/L、(2.76±1.41)ng/L,差异均有统计学意义(P<0.05)。D-S分期Ⅲ期多发性骨髓瘤患者血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平分别为(8.78±1.88)mg/L、(1.92±0.57)mg/L、(9.13±1.77)ng/L,高于D-S分期Ⅰ~Ⅱ期患者的(7.56±1.57)mg/L、(1.37±0.36)mg/L、(7.78±1.59)ng/L,差异均有统计学意义(P<0.05);ISS分期Ⅲ期多发性骨髓瘤患者血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平分别为(9.32±1.67)mg/L、(2.56±0.73)mg/L、(9.33±1.11)ng/L,高于ISS分期Ⅰ~Ⅱ期患者的(7.62±1.54)mg/L、(1.20±0.43)mg/L、(8.12±1.71)ng/L,差异均有统计学意义(P<0.05)。血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平与D-S分期、ISS分期均呈正相关(P<0.001)。治疗3个月后,治疗无效组血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平高于治疗有效组,差异均有统计学意义(P<0.05)。血清β2-MG、Cys-C、DKK1水平联合检测预测多发性骨髓瘤患者预后的AUC、敏感度、特异度分别为0.822、83.91%、92.86%。结论:多发性骨髓瘤患者血清β2-MG、Cys-C、DKK1处于较高水平,三者联合检测对多发性骨髓瘤患者的预后具有较好的预测价值,可作为判断疗效和预后的血清学指标。

TACE联合射频消融后复发性肝癌患者血清E-cadherin、VEGF、DKK1变化及对生存预后的影响

目的:分析复发性肝癌患者经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)联合射频消融后血清上皮钙黏素(E-cadherin)、血管内皮生长因子(VEGF)、分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK1)变化及对生存预后的预测价值。方法:选取2016年1月至2022年3月苏州市立医院收治的190例肝癌术后复发患者,均给予TACE联合射频消融治疗,根据生存预后分为死亡组(30例)、生存组(160例)。比较两组基线资料、治疗前、TACE后、射频后血清E-cadherin、VEGF、DKK1变化;采用Cox分析生存预后的相关影响因素;采用受试者工作特征曲线(ROC)分析TACE后、射频后血清E-cadherin、VEGF、DKK1预测生存预后的价值;采用卡普兰—迈耶曲线(KM)生存曲线分析不同血清E-cadherin、VEGF、DKK1表达水平患者生存率。结果:死亡组BCLC分期高于生存组(P<0.05);死亡组TACE后、射频后血清E-cadherin低于生存组,VEGF、DKK1高于生存组(P<0.05);Cox分析显示,射频后血清Ecadherin是复发性肝癌患者生存预后的相关保护因素,BCLC分期、射频后血清VEGF和DKK1是复发性肝癌患者生存预后的相关危险因素(P<0.05);射频后血清E-cadherin、VEGF、DKK1预测生存预后的ROC下面积(AUC)大于TACE后,且血清Ecadherin+VEGF+DKK1的AUC大于单独的血清E-cadherin、VEGF、DKK1(P<0.05);血清E-cadherin高水平患者生存率高于低水平患者,VEGF、DKK1高水平患者生存率低于低水平患者(P<0.05)。结论:血清E-cadherin、VEGF、DKK1变化与复发性肝癌TACE联合射频消融后生存预后有关,联合检测射频后三者表达水平为临床预测生存预后提供参考依据。

DKK1与尿蛋白在子痫前期中的研究进展

子痫前期(Preeclampsia, PE)作为妊娠期特有并发症,大量潜在的生物标记物已被发现,协助于诊断并治疗PE病情。WNT信号通路是调控生物体内细胞生长、发育及分化的关键信号传导通路之一,在PE发病中起到关键作用。DKK1作为WNT信号通路的拮抗剂,其蛋白表达水平与子痫前期的发病率密切相关,并且现已证实DKK1参与肾脏的病变,成为子痫前期蛋白尿症状的影响因素之一。通过探究DKK1在母体血清中的表达情况,联合尿蛋白水平,探讨二者在PE发病中起到的作用。

经阴道彩色多普勒超声、动态对比增强磁共振成像联合血清DKK1、CA724、NLR对子宫内膜癌的诊断价值研究

目的探讨经阴道彩色多普勒超声(TVCDU)、动态对比增强磁共振成像(DCE-MRI)联合血清Dickkopf-1(DKK1)、糖类抗原724(CA724)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)对子宫内膜癌(EC)的诊断价值研究。方法回顾性分析2018年01月至2021年12月于我院行手术治疗并经病理检查证实的68例EC患者(EC组)及52例子宫内膜息肉(EP)患者(EP组)的临床资料。比较两组间TVCDU、DCE-MRI定量参数以及血清DDK1、CA724、NLR水平的差异。建立受试者工作特征(ROC)预测分析模型,比较TVCDU、DCE-MRI、血清DKK1、CA724、NLR单独及联合诊断EC的诊断效能。结果TVCDU显示EC组子宫内膜病灶内部回声不均匀、与邻近肌层分界不清晰,子宫内膜厚度、血流丰富所占比例显著高于EP组(P<0.05),而血流阻力指数(RI)、搏动指数(PI)、平均血流速度(TAP)水平显著低于EP组(P<0.05)。DCE-MRI显示EC组的子宫内膜病灶主要表现为不规则增厚或肿块,T_(2)WI表现为等或稍高信号影,DCE主要表现早期强化后迅速下降,EC组的子宫内膜病灶的最大直径、DCE定量参数容积转运常数(Ktrans)、转运速率常数(Kep)、血管外细胞外容积分数(Vc)显著高于EP组(P<0.05)。EC组血清DKK1、CA724及NLR水平显著高于EP组(P<0.05)。ROC分析结果显示:TVCDU、DCE-MRI联合血清DKK1、CA724、NLR水平对EC鉴别诊断的准确性、敏感度、特异度最高。结论TVCDU、DCE-MRI联合血清DKK1、CA724、NLR水平有助于提高EC的鉴别诊断效能,进一步为临床提供真实客观的影像学和实验室证据。

新疆绝经后2型糖尿病女性DKK1基因rs1896367、rs2241529位点的基因多态性及突变与骨代谢的关系

目的:探讨新疆地区绝经后2型糖尿病(T2DM)女性DKK1基因rs1896367、rs2241529位点的基因多态性及突变与骨代谢指标的关系。方法:选取新疆地区绝经后T2DM女性136例,根据病史,糖耐量试验(OGTT)及双能X线(BMD)分为4组:A组(糖耐量正常伴骨量正常组26例),B组(糖耐量正常伴骨量异常组28例),C组(T2DM伴骨量正常组27例),D组(T2DM伴骨量异常组55例)。测定并记录空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三脂(TG)、钙(Ca)、磷(P)等临床生化指标;Sequenom飞行时间质谱法测定DKK1基因rs1896367、rs2241529位点的基因多态性;双能X线吸收法(dual energy X-ray, DEXA)测定腰椎(L1-4)、股骨颈的骨密度(bone mineral density, BMD)。结果:1) DKK1基因rs1896367位点:与A组相比,B组、C组、D组的基因型及等位基因的频率分布有统计学差异(P < 0.05);DKK1基因rs2241529位点:与A组相比,C组、D组的基因型及等位基因的频率分布有统计学差异(P < 0.05);2) LDL-C测定:DKK1基因rs1896367、rs2241529位点突变型(AG + AA;AG + GG) (3.389 ± 1.038;3.445 ± 1.045)低于野生型(GG;AA) (4.835 ± 0.035;4.835 ± 0.035),(P<0.05);3) 多元线性回归结果:绝经年限、甘油三脂是BMD (L1-4)及BMD (股骨颈)影响因素(P < 0.05)。结论:1) 在新疆绝经后T2DM女性中,DKK1基因rs1896367、rs2241529位点的基因多态性与糖、骨代谢有关。2) 多元线性回归方程结果显示:绝经年限增高、及甘油三脂的降低是BMD降低的危险因素。

舌鳞状细胞癌中DKK1的表达及分子机制

目的应用生物信息学和分子生物学实验探讨Dickkopf相关蛋白1(DKK1)在舌鳞状细胞癌(TSCC)中的表达及分子机制。方法从TCGA-TSCC数据库下载患者信息,利用NetworkAnalysed网站筛选正常组织和癌组织间的差异表达基因,通过Kaplan-Meier分析和Lasson回归法寻找关键基因及临床预后,应用GO和KEGG分析差异表达基因的功能和通路,应用UALCAN数据库和免疫组化实验分析DKK1蛋白在TSCC中的表达,并分析其与临床病理特征的关系,应用Western blot实验检测DKK1在TSCC细胞中的表达,利用siRNA敲低Cal27细胞中DKK1蛋白的表达。结果NetworkAnalysed、Kaplan-Meier分析和Lasson回归法筛选出的3个关键基因DKK1、CYP19A1和IRX4在TSCC中高表达,且高表达组的患者生存率差。UALCAN数据库分析显示DKK1的mRNA水平在TSCC组织中高于正常组织,其高表达与TSCC患者的临床分期、组织学分级和淋巴结转移相关。免疫组化实验显示,DKK1蛋白在临床分期Ⅲ+Ⅳ期TSCC组织中的阳性率高于Ⅰ+Ⅱ期TSCC组织。与癌旁组织相比,DKK1蛋白在TSCC组织中的表达水平升高。Western blot实验显示DKK1蛋白在TSCC细胞Cal27中的表达高于正常口腔上皮细胞HOEC。在TSCC细胞Cal27中敲低DKK1的表达后,β-catenin、p-p65和p65蛋白表达量减少。结论DKK1在TSCC组织和细胞中高表达且发挥重要作用,其可能作为TSCC早期诊断和药物治疗的新靶点。

多层螺旋CT参数联合ProGRP、DKK1在肺癌诊断中的价值分析

目的:探讨多层螺旋CT参数联合胃泌素释放肽前体(Progastrin releasing peptide,ProGRP)、分泌蛋白DKK1(Dickkopf-1,DKK1)在肺癌中的诊断价值。方法:随机收集2020年7月至2021年7月我院接受的87例肺癌患者为研究组,另选取在本院体检健康人员100例为对照组。分别采用电化学发光法、酶联免疫吸附法测定受检者ProGRP、DKK1水平,记录多层螺旋CT影像参数,包括表面通透性(Permeability surface,PS)、血容量(Blood volume,BV)、平均通过时间(Mean transit time,MTT)值,分析多层螺旋CT联合ProGRP、DKK1在肺癌诊断中的应用价值。结果:相比对照组,研究组多层螺旋CT参数PS、BV、MTT值较高(P<0.05),相比Ⅰ~Ⅱ期,Ⅲ~Ⅳ期患者多层螺旋CT参数PS、BV、MTT及血清ProGRP、DKK1水平升高(P<0.05),肺癌患者多层螺旋CT参数PS、BV、MTT及血清ProGRP、DKK1与临床病理分期均呈正相关,且多层螺旋CT参数PS、BV、MTT与ProGRP、DKK1水平呈正相关(P<0.05)。与多层螺旋CT参数、ProGRP、DKK1单项检查相比,三项联合对肺癌的临床诊断价值较高(P<0.05)。结论:多层螺旋CT参数与ProGRP、DKK1水平及肺癌TNM分期间存在线性关联,为肺癌发展诊断提供重要量化参考。

基于生物信息学探索DKK1在肺腺癌发生中的作用

背景与目的肺癌是我国最常见的恶性肿瘤,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是肺癌的主要类型,严重威胁着人民的生命健康,目前关于血清分泌型蛋白1(Dikkopf 1,DKK1)在LUAD中的作用研究较少,本研究旨在通过生物信息学方法探究DKK1在LUAD发生发展中的作用及潜在的预后价值。方法应用基因型组织表达(genotype-tissue expression,GTEx)、癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和肿瘤与免疫系统交互网站(tumor-immune system interactions database,TISIDB)等多个数据库,对DKK1在LUAD中的表达、临床病理特征、免疫细胞浸润、预后和甲基化等进行分析,同时应用LinkedOmics数据库分析DKK1的共表达基因及其功能富集。收集2016年至2017年于新疆医科大学附属肿瘤医院行手术治疗的59例石蜡包埋的LUAD患者病理样本,通过免疫组织化学试验(immunohistochemistry,IHC)进行表达预后验证。结果生信分析结果显示DKK1在LUAD组织的表达水平高于正常组织,晚期癌症中的表达高于早期阶段,实验验证后发现59例LUAD中阴性表达15例(25.4%),弱阳性表达18例(30.5%),强阳性表达26例(44.1%)。DKK1的不同表达情况与甲基化、预后以及多种免疫细胞的活动相关。功能富集显示DKK1可能参与表皮发育、细胞-基质连接等过程,京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析表明DKK1与ABC转运蛋白相关。生物信息学分析及临床病例标本显示DKK1高表达与LUAD患者较差的预后有关。结论DKK1在LUAD中高表达,与患者预后不良有关,并且DKK1与肿瘤免疫细胞浸润和通路密切相关。DKK1可能是LUAD潜在的预后标志物和免疫治疗新靶点。

原发性骨质疏松症患者血清中sFRP4 DKK1表达及临床意义

目的:分析原发性骨质疏松症患者血清中sFRP4、DKK1表达及临床意义。方法:选取本院2019年1月至2021年1月期间收治的82例原发性骨质疏松症患者作为研究组,另选取同期健康体检者75例作为对照组,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sFRP4、DKK1水平,采用电化学发光法检测血清β胶原降解产物(β-CTX)、Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP)、骨桥蛋白(OPN)以及N端骨钙素(N-MID)水平,使用骨密度仪检测股骨BMD值以及腰椎L_(1~4)BMD值。采用Pearson法分析血清sFRP4、DKK1水平与骨代谢指标以及骨密度之间的相关性;采用Logistics回归分析原发性骨质疏松症的影响因素;受试者工作特征曲线(ROC)分析血清sFRP4、DKK1水平对原发性骨质疏松症的诊断价值。结果:研究组血清sFRP4(62.98±10.79)μg/L和DKK1(14.28±3.97)μg/mL表达水平显著高于对照组(46.87±8.88)μg/L和(11.43±3.04)μg/mL(P<0.05),研究组β-CTX(4.52±1.02)ng/mL、P1NP(47.28±4.26)ng/mL、OPN(26.64±5.11)ng/mL以及N-MID(89.87±8.02)ng/mL显著高于对照组(3.55±0.92)ng/mL、(30.84±4.53)ng/mL、(19.01±4.12)ng/mL和(81.95±9.50)ng/mL(P<0.05),研究组股骨BMD(0.58±0.16)g/cm^(3)和腰椎L_(1~4)BMD(0.64±0.18g/cm^(3))显著低于对照组(0.82±0.19)g/cm^(3)和(0.83±0.23)g/cm^(3)(P<0.05)。根据pearson相关性分析得知,sFRP4和DKK1的表达水平呈正相关性(P<0.05),sFRP4和DKK1表达水平与股骨BMD和腰椎L_(1~4)BMD呈负相关(P<0.05),与β-CTX、P1NP、OPN和N-MID呈正相关(P<0.05)。根据Logistic回归分析得知,sFRP4、DKK1高表达是影响原发性骨质疏松症发生的危险因素(P<0.05)。血清sFRP4诊断原发性骨质疏松症的AUC为0.874,DKK1诊断原发性骨质疏松症的AUC为0.809,二者联合诊断原发性骨质疏松症的AUC为0.921,优于血清sFRP4和DKK1各自单独诊断(Z联合vs sFRP4=2.851、Z联合vsDKK1=4.365,P均<0.05)。结论:血清sFRP4和DKK1在原发性骨质疏松症患者中显著升高,与患者的骨代谢和BMD密切相关,二者联合可更好的诊断原发性骨质疏松症。

重组DKK1及pCMV-HA2/DKK1重组质粒对宫颈癌细胞体外增殖作用的影响

目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,western blot及ELISA法检测转染pCMV-HA2/DKK1重组质粒后Hela细胞中DKK1蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10,50 ng/mL的DKK1对Hela细胞有明显抑制作用(F分别为162.31,184.65,P均<0.01);抗DKK1抗体对Hela细胞的增殖影响无统计学意义(P均>0.05);pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后对细胞增殖有明显抑制作用,加入抗DKK1抗体不能完全拮抗pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞的抑制作用;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后可检测到DKK1蛋白表达,经western blot证实为DKK1蛋白(Mr约为38 000),ELISA法结果表明,DKK1蛋白的分泌量随培养时间的延长而增加,第5天时达峰值(19.82 mg/L)。结论重组DKK1和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1可抑制Hela细胞的增殖,抗DKK1抗体可部分抵抗DKK1的抑制作用,提示DKK1在宫颈癌肿瘤发生中对肿瘤细胞具有抑制作用。

补肾健脾活血方干预过表达DKK1骨细胞对细胞活性及BMP2的影响

目的用补肾健脾活血方干预过表达的DKK1腺病毒转染的成骨细胞,通过观察细胞的活性及BMP2的表达,研究补肾健脾活血方治疗骨质疏松的分子生物学机制。方法将培养细胞分成NC对照组,Ad-DKK1组两组。NC对照组由空载腺病毒转染;Ad-DKK-1组由包装过表达的DKK1腺病毒转染。每组分别用含药血清和空白血清干预。采用CKK-8检测细胞增殖,蛋白印记法检测BMP2的表达。结果各组细胞活性变化:空白血清和含药血清干预均能提高细胞活性。与空白血清分别干预的两组比较,含药血清分别干预后的两组,在24 h,48 h,72 h的细胞活性的增加倍数都较多;在采用蛋白印记法检测后,BMP2在含药血清分别干预的两组的相对表达量较空白血清分别干预的两组的相对表达量高(P<0.01,P<0.01),在NC对照组中含药血清干预与空白血清干预无明显差异。结论补肾健脾活血方含药血清可以提高细胞活性,提高BMP2的相对表达量,有利于成骨细胞的矿化,尤其在过表达DKK1干预后。补肾健脾活血方可能通过调控DKK1进而影响成骨细胞的代谢。

Dickkopf(DKK1)在肝癌组织及多种人肿瘤细胞系中的表达分析

目曲：检测dickkopf（DKK1）在肝癌组织及多种恶性肿瘤细胞系中的表达情况。方法：采用酶联免疫吸附实验、real time PCR、RT—PCR及Western blot对DKK1在肝癌组织及多种恶性肿瘤细胞系的表达情况进行检测。结果：肝癌组织检测RT—PCR，10／15肝癌中高表达；Real—time PCR方法检测，8／8肝癌中高表达；Western blot方法检测，5／8肝癌中高表达。酶联免疫吸附实验检测到DKK1在多种恶性肿瘤细胞系的细胞培养液上清液中均有表达，蛋白质表达量波动于5～210ng／mL之间；10种人恶性肿瘤细胞系在mRNA水平和蛋白质水平DKK1的表达均能检测到。结论：DKK1高表达于肝癌组织及广泛表达于多种恶性肿瘤细胞系，提示DKK1可能在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。

沉默DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞增殖、ALP活性和钙离子浓度影响研究

目的构建Wnt信号通路抑制因子Dickkopf1(DKK1)、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因沉默重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和钙离子浓度影响作用。方法设计出特异性针对DKK1、Sost和无关对照序列(Scr),构建DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,用q PCR法和蛋白印记(Western blot)法选出沉默效率最好的扩增DKK1、Sost沉默重组腺病毒载体,并用荧光显微镜观察计算病毒滴度。MG63细胞被分成空白对照组、沉默DKK1(Ad-sh DKK1)组、沉默Sost(Ad-sh Sost)组、沉默DKK1+Sost(Ad-sh DKK1+Ad-sh Sost)组4组,分别用优选出的沉默效率最好的sh DKK1和sh Sost腺病毒载体转染MG63细胞,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)检测观察细胞增殖、考马斯亮蓝蛋白定量法测定ALP活性、流式分析法测定钙离子浓度。结果 1DKK1 p Ad-sh DKK1-1和Sost p Ad-GFP-shRNA-2沉默效率最高;2与空白对照组对比,沉默DKK1组、沉默Sost组、沉默DKK1+Sost组的细胞光吸收值(OD)、ALP活性测定值均升高,而钙离子浓度均降低,以沉默DKK1+Sost组变化最明显,组间比较具有统计学差异(P<0.01和P<0.05)。结论 DKK1、Sost沉默可促进MG63细胞增殖、提高ALP活性,降低钙离子浓度,尤以二者同时沉默时的作用最强。

过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞和相关蛋白的影响

【目的】针对Wnt信号通路抑制因子Dickkopf(DKK)1、骨硬化蛋白Sclerostin(Sost)基因构建过表达重组腺病毒载体,观察其对MG63细胞和相关蛋白的影响。【方法】构建DKK1、Sost过表达重组腺病毒载体,将培养好的MG63细胞分为空白对照组、空载病毒组(NC对照组)、过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组5组,根据组别不同分别用上述过表达重组腺病毒感染MG63细胞,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙离子浓度和骨调节蛋白表达情况。【结果】与空白对照组比较,过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组的细胞光密度值、ALP活性值均显著降低,而钙离子浓度显著升高,以过表达DKK1+Sost组变化最明显(P<0.01)。与空白对照组比较,过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组的骨保护蛋白(OPG)、低密度脂蛋白受体相关蛋白(Lrp)5、骨形态发生蛋白(BMP)2、结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)2、骨桥蛋白(OPN)表达量均降低,而肿瘤坏死因子(TNF)-α表达量则升高,以过表达DKK1+Sost组变化最明显,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。【结论】过表达DKK1、Sost可降低MG63细胞增殖和ALP活性,升高钙离子浓度,对骨调节蛋白有一定影响,尤以两者同时过表达时的作用最强。