中华鳖Dkkl1基因的分子特征及对外源性激素处理的响应

Dkkl1基因在哺乳动物睾丸发育和精子发生过程中扮演着重要角色,然而其在龟鳖类动物中的研究十分有限。为探索龟鳖类Dkkl1基因的潜在功能和作用机制,克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)Dkkl1基因的cDNA片段,分析其序列特征、表达模式以及对外源性激素处理的响应。克隆获得的Dkkl 1基因cDN A序列长度为823 bp,其中3'-非编码区(UTR)为67 bp,5'UTR为90 bp,开放阅读框为666 bp,共编码222个氨基酸。中华鳖Dkkl1蛋白是一种稳定性较差、亲水性较强的碱性蛋白,其二级结构和三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。氨基酸序列同源性比对结果显示其与中华草龟(Chinemys reevesii)Dkkl1蛋白的相似性较高(81%),与棱皮龟(Dermochelys coriacea)Dkkl1蛋白的同源性较低(70%)。通过RT-PCR和RT-qPCR分析发现,中华鳖Dkkl1 mRNA在3冬龄成体精巢中极显著性高表达(P<0.001),而在其余体组织中几乎不表达。并且随着年龄的增长,中华鳖精巢中Dkkl1基因的表达量逐渐上升,并在3冬龄时达到顶峰。此外,17β-雌二醇(E2)和17α-甲基睾酮(17α-MT)处理均可显著抑制成体中华鳖精巢中Dkkl1基因的表达(P<0.05)。研究表明,Dkkl1基因可能在中华鳖睾丸发育和精子发生过程中起着重要作用。

精子顶体相关基因DKKL1在正常人和男性不育患者睾丸组织中的表达差异

目的:研究精子顶体相关基因DKKL1在正常人和男性不育患者睾丸组织中的表达差异。方法:采用RT-PCR和Western Blot方法检测DKKL1基因在人多组织中的表达特征,并比较其在正常人和男性不育患者睾丸组织中的表达差异。采用免疫组化方法分析DKKL1蛋白在正常和男性不育患者睾丸组织中的表达差异。结果:人多组织RT-PCR和Western Blot结果显示DKKL1基因为睾丸组织特异性表达,与正常人睾丸组织比较,DKKL1基因在男性不育患者睾丸组织中表达减弱或消失。免疫组化结果显示DKKL1蛋白主要定位在正常男性睾丸的精母细胞和圆形精子细胞,而在唯支持细胞综合征(SCOS)和隐睾患者睾丸组织中不表达,在各种生精细胞阻滞患者的睾丸中观察到不同的表达特征。结论:DKKL1基因在男性不育患者睾丸组织中对精子发生可能具有重要作用,其表达降低或消失可能是男性不育症发生的重要原因之一。

乳腺癌中DKKL1的表达、作用及机制探讨

目的:研究Dickkopf样蛋白1(dickkopf-like protein 1,DKKL1)基因在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平,探讨DKKL1基因过表达对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖、迁移的影响及其分子作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR检测乳腺癌细胞系、80例人乳腺癌和癌旁组织以及20例正常乳腺组织中DKKL1 mRNA的表达水平;免疫组织化学法检测人乳腺癌组织中DKKL1蛋白的表达水平并分析与患者临床病理特征的相关性。选取表达水平最低的MDA-MB-231和MCF-7细胞,分别转染空载体pcDNA3.1(+)-Flag质粒(作为对照组)和重组pcDNA3.1(+)-Flag-DKKL1质粒(作为实验组)后,采用蛋白质印迹法验证DKKL1蛋白是否过表达;然后分别采用CCK-8法、软琼脂克隆形成实验、吖啶橙/溴化乙锭双染实验和Transwell小室迁移实验检测MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖和迁移的变化;并采用蛋白质印迹和实时荧光定量PCR法分别检测DKKL1过表达对上皮-间质转化及下游靶分子表达和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的影响。结果:人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、BT549、MDA-MB-468、T47D和ZR-75-1中DKKL1 mRNA表达水平均明显低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A(P值均<0.001)。与20例正常乳腺组织和80例配对癌旁组织相比,人乳腺癌组织中DKKL1 mRNA和蛋白表达均明显下调(P值均<0.01);DKKL1蛋白表达与乳腺癌的淋巴结转移、组织学分级及TNM分期具有明显相关性(P值均<0.05)。DKKL1过表达质粒转染后,乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中DKKL1蛋白的表达水平明显上调,而细胞增殖、克隆形成、凋亡和迁移能力均被明显抑制(P值均<0.001)。DKKL1过表达可上调上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)mRNA及蛋白表达水平,同时下调波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail、BMI-1、KLF4和CD44 mRNA及蛋白的表达水平(P值均<0.001)。DKKL1过表达后活化的β-catenin蛋白、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)蛋白及其下游c-Myc和cyclin D1蛋白的表达水平均明显下调(P值均<0.001)。结论:乳腺癌组织和细胞系中DKKL1表达水平下调,可能通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路调控乳腺癌的发展进程。

精子顶体相关蛋白Dkkll在小鼠睾丸组织中的表达研究

目的：研究顶体相关蛋白Dkkl1在小鼠睾丸组织发育过程中的表达特征。方法将4d、9d、18d、35d、54d和6月龄小鼠睾丸组织cDNA探针与Affymetrix全基因组芯片进行杂交，筛选出差异表达的Dkkl1基因。采用RT-PCR方法检测Dkkl1基因在小鼠不同日龄和不同组织中的表达情况，采用免疫组化方法检测Dkkl1蛋白在小鼠睾丸组织中的定位。结果对Affymetrix全基因组芯片杂交结果分析后，筛选得到1个差异表达杂交点，通过在NCBI网站与小鼠全基因组序列Blast分析可知该差异表达基因是Dkkl1基因。RT-PCR结果表明Dkkl1 mRNA呈小鼠睾丸特异性表达，在出生31d小鼠睾丸开始高表达，在成年前达到高峰。Dkkl1蛋白主要定位在睾丸精母细胞和圆形精子细胞。结论 Dkkl1基因存在发育的表达调控，为小鼠年龄依赖性表达基因，其表达与小鼠精子发生的过程有很强的一致性，且具有睾丸特异性表达的特征，因此我们推测该基因可能在精子发生中具有关键作用。