D-对羟基苯甘氨酸的酶法生产工艺研究

利用自行从土壤中分离的假单胞菌 sp.2 2 6 2产生的酶 ,在诱导剂的作用下 ,建立了以 DL-对羟基苯海因为底物制备 D-对羟基苯甘氨酸的方法 ,确定了发酵及酶转化的最佳工艺条件。

化学酶法合成D-对羟基苯甘氨酸

采用乙二醛、苯酚和尿素为原料化学合成底物ＤＬ－对羟基苯乙内酰脲。以沟槽假单孢菌ＣＰＵ１６２８或放线形土壤杆菌ＣＰＵ１２１１为酶源，将ＤＬ－对羟基苯乙内酰脲生物转化为Ｄ－对羟基苯甘氨酸，产率分别为８６％和８０％。

D-对羟基苯甘氨酸产生菌的筛选研究

目的采用多种筛选方法以获得D-海因酶及N-氨甲酰水解酶的阳性菌株。方法通过以底物(对羟基苯海因)为唯一氮源的培养基从土样和水样中初步分离,然后利用双层琼脂法和微孔快速筛选法对分离到的菌株以及实验室保藏的菌株进行筛选,得到D-海因酶阳性菌株。用茚三酮显色法及纸色谱法进一步筛选N-氨甲酰水解酶阳性菌株。结果最终获得D-海因酶阳性菌株54株,从这54株菌中筛选到2株产N-氨甲酰水解酶的阳性菌株,从而获得了可同时产生双酶的菌株。结论几种不同筛选方法和测定方法的配合使用提高了阳性菌株的获得机会,为进一步诱变得到高产菌株,建立基因工程菌,获得基因工程药物奠定了基础。

D-对羟基苯甘氨酸生产过程的高效毛细管电泳法分析

建立了高效毛细管电泳法测定酶法反应体系中D-对羟基苯甘氨酸、DL-对羟基苯海因、N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸的含量。采用未涂层石英毛细管柱,运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH9.0),检测波长230nm。分离电压30kV,进样压力0.5psi,进样时间5s,采用苯酚为内标。三成分均在0.01%～0.1%范围内线性关系良好。

海因酶产生菌的反应条件研究

利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)作为酶源,研究海因酶催化DL-对羟基苯海因合成N-氨基甲酰-D-对羟基苯甘氨酸,以制备D-对羟基苯甘氨酸,并就培养基的优化,反应条件的选择及酶活的影响作了探讨.研究表明,碱性条件下可显著增加酶反应速度,温度对提高海因酶活力有重要影响.培养初始pH值为7.0,温度28℃下培养24 h产海因酶达最高;在最适pH9.0和最适温度55℃下,海因酶活力达到0.7 u/mL,比原基础培养条件下提高3.5倍.