基于SCAR标记和DNA条形码技术的苍术基原鉴别研究

目的开发出能同时鉴别北苍术和关苍术的分子标记方法,并探究不同种质资源苍术的遗传进化关系。方法对不同地区北苍术Atractylodes chinensis(Bunge)Koidz及关苍术A.japonica Koidz.ex Kitam基因组DNA的差异片段进行测序,结合SRAP、ISSR、DAMD分子标记方法,优化PCR反应体系,筛选并转换成特异性标记,同时,采用条形码方法分析种间序列差异。结果通过SRAP、ISSR、DAMD三种分子标记方法的PCR扩增,共筛选出198对能稳定扩增且重现性好的引物,转换出7对能稳定、快速鉴别北苍术和关苍术的SCAR引物。条形码方法检测出北苍术ITS2序列长度为454 bp,关苍术ITS2序列长度为453 bp,与其他苍术属植物之间遗传距离较远。NJ树结果显示,北苍术、关苍术及其他苍术属植物均各自聚为一支,表现出良好的单系性。依据ITS2二级结构,4种苍术属植物在螺旋区的茎环数目、大小、位置均有明显差异,可以直观地进行区分。结论所开发的特异性SCAR标记为苍术属植物优良品种的筛选提供了新方法,DNA条形码能稳定、准确鉴别北苍术。

土壤微生物分子生态学研究中总DNA的提取

建立了一种土壤DNA提取方法。根据DNA产量和纯度2个评价指标,从3种手提土壤DNA方法中优选出方法B为手提DNA方法(Labmethod),它包括样品预处理,细胞裂解,粗DNA纯化,其中细胞裂解组合了玻璃珠击打,SDS裂解,溶菌酶裂解。进一步应用PCR-限制性片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)技术及PCR-温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)技术,结合DNA产量、纯度、片段大小以及所反映的微生物群落结构特性等指标评价了手提方法(Labmethod)得到的总DNA质量,并将这些结果与2种应用较广的商业试剂盒(MoBioUltraCleanSoilDNAKit和Bio101FastDNASPINKit(ForSoil))所得DNA的各种指标进行了比较。结果表明,手提方法(Labmethod)的粗DNA产量低于Bio101Kit的,但高于MoBioKit的。这些方法所得DNA的长度都在21kb左右,Labmethod提取的DNA没有严重被剪切现象,而2种试剂盒提取的DNA都有不同程度的剪切。手提方法得到的DNA经纯化后,应用细菌及真菌特异引物进行PCR扩增,均能获得目的片段,表明该方法能从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组DNA。并且,手提方法所得DNA的细菌16SrDNA和真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱与两种商业试剂盒的图谱基本相似,但3种方法提取的DNA在细菌16SrDNAV3区和真菌28SrDNA片段的PCR-TGGE图谱上都存在一定差异,主要表现在一些弱势条带的有无或强弱上。这说明手提方法提取的总DNA与2种商业试剂盒一样,在一定程度上能反映微生物群落的多样性和组成。总之,手提DNA方法(Labmethod)所用试剂普通,价格便宜,能在4h以内获得够质够量的土壤DNA用于微生物分子生态学研究,较适合于广大普通实验室进行土壤DNA提取工作。

红莲型水稻与细胞质雄性不育相关mtDNA片段的分离及序列测定

应用AFLP分析技术,比较了红莲型水稻雄性不育系和保持系线粒体DNA,找到一不育系特异条带TA1。以该条带DNA为探针与不育系、保持系以及F_1杂种线粒体总RNA杂交,结果显示该片段黄化苗期三者均转录一个RNA分子,但转录产物分子量各不相同,说明三者该片段阅读框架不同。经测序,该片段长202bp,序列内含密码子ATG、ATT、AGA、AGG以及正向重复序列5’TGTAC3’、5’ATTATTTT3’和倒转重复序列5’GGGAAACA3’。上述特点表明该片段可能是某一蛋白编码序列,并可能与红莲型水稻雄性不育性状形成有关。

红景天属植物DALP反应体系的建立

目的 利用直接扩增片段长度多态(DALP)这一新分子标记技术建立一套稳定的红景天属植物的DALP反应体系。方法 以红景天基因组DNA为模板,对DALP反应程序的一些重要参数进行摸索和优化试验。结果 建立了一套稳定性强、可靠性高的DALP应用反应体系;经过大量重复性实验,反应体系为20μL,Mg2+浓度为2.5 mmol/L,dNTPs浓度为1.25 mmol/L,模板DNA的量为60 ng,5 pmol/L选择性引物1μL,5 pmol/L反向引物3 μL,引物浓度比为1:3,Taq酶2 U。反应过程为:95℃预变性5 min、94℃变性30 s、50℃退火30 s、72℃延伸1 min;30个循环,再72℃延伸10 min,完成整个PCR反应。结论 该体系可有效地应用于红景天属药材的分类鉴定和地道性鉴定。

汤洪敏云南野生大白口蘑遗传多样性研究

应用DALP技术对云南野生大白口蘑遗传多样性进行分析.筛选的5组引物在大白口蘑6个菌塘的56朵子实体中检测到202个位点,其中多态位点151个,多态位点百分比PPB为74.75%.6个菌塘总的观察等位基因数Na为1.7475;总的有效等位基因数Ne为1.4659;Nei＇s基因多样性指数H为0.2722;总的Shannon多样性指数I为0.4053;菌塘总的基因多样度Ht为0.2705,菌塘内基因多样性度Hs 为0.012,菌塘间基因分化系数 Gst 为0.9556,菌塘的遗传一致度在0.60～0.80之间.结果表明大白口蘑遗传变异有95.56%存在菌塘间,4.44%存在菌塘内,即大白口蘑遗传变异绝大多数存在于菌塘之间.

柑橘衰退病毒柚类分离株的分子鉴定

应用限制性片段长度多态性（RFLP）、双向逆转录-聚合酶链式反应（BD-PCR）、序列分析等技术对我国部分地区柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）柚类分离株进行了鉴定分析。结果表明：柚类以受相对单一的CTV株系侵染为主；柚类上的优势流行株系属于p25／Hin f ⅠRFLP6组群（占79．4％）和p23／BD-PCRⅢ组群（占84．1％）；在对柚类CTV分离株S051～S058及国外CTV分离株PB61、T30、T36、T385、SY568、VT、NUAGA的p23、p25基因序列分析中，S051与弱毒株PB61的同源性最高；S052与弱毒株T30、T385的同源性最高；S053、S054、S055、S056、S057、S058与其它CTV分离株的同源关系均较远，并在系统发生树上形成了独立的分枝。

亚洲百合种内杂交后代的多态性及其分离

利用7对DALP引物组合对5个亚洲百合杂交组合后代的多态性及分离方式进行了研究。结果表明,筛选出的7对DALP引物共检测出136个位点,5个杂交组合共得到680个位点,其中多态性位点为379个,多态性位点出现的平均频率是55.7%,呈现出的多态性较高;DALP标记在杂交后代中的分离方式有不分离、发生分离和异常分离3种方式。3种分离方式出现的平均频率与数量分别为44.3%、60;41.8%、57;14.1%和19。该研究结果可为进一步构建百合遗传图谱打下良好的基础,并提供了一定的理论依据。

体外6种疱疹类病毒DNA扩增及其基因分型

目的 快速检测 6种疱疹类病毒DNA。方法 在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中设计两对通用引物 ,一对扩增单纯疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型、爱泼斯坦 巴尔病毒和人巨细胞病毒 4种病毒 ,另一对扩增水痘 带状疱疹病毒和人类疱疹病毒 6型 2种病毒。经DNA聚合酶链反应(PCR)扩增 ,并对扩增产物进行分子克隆序列分析后 ,选择BamHⅠ或BstUⅠ酶切对扩增产物进行鉴别。结果 6种标准病毒株PCR扩增后产物为 5 10～ 5 92bp ,其最小检出量为 0 .1fg ,与乙型肝炎病毒、真菌、细菌和人类基因组DNA无交叉反应。用该方法检测临床 89份脑脊液 (CSF)和 75份血标本中的疱疹类病毒 ,13份 (14 .6 % )CSF和 2 6份 (34.7% )血标本为阳性 ,通过BamHⅠ或BstUⅠ两种酶切后能明确系何种疱疹类病毒。同时用酶联免疫吸附 (ELISA)法检测该标本的HSVⅠ /Ⅱ、EBV和CMV这 4种病毒的IgM ,10例阳性。这 4种病毒的PCR阳性检出率为 30 .7% ,而ELISA法为13.3% (P <0 .0 5 ) ,具有显著的差异性。 38例正常健康儿童的血和 9份非病毒感染的CSF标本 6种疱疹类病毒DNA均为阴性。结论 PCR加限制性内切酶片段长度多态性分析具有特异敏感 ,快速准确的特点 ,为疱疹类病毒感染的早期快速诊断提供了有效的手段。

林下参与栽培参扩增片段长度多态性指纹图谱鉴定

目的探讨林下参与栽培参DNA直接扩增片段长度多态性(direct amplification of length polymorphisms,DALP)特征,建立林下参与栽培参直接扩增片段长度多态性指纹鉴定图谱。方法采用改进十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取林下参和栽培参基因组DNA,设计6条随机引物,优化直接扩增片段长度多态性体系,进行PCR扩增。结果采用改进的十六烷基三甲基溴化胺法从人参样品中提取到约为19 kb左右的基因组DNA,其纯度在(1.80±0.23)之间,并获得林下参与栽培参的直接扩增片段长度多态性指纹图谱。结论获得的林下参直接扩增片段长度多态性图谱具有指纹特征,可以作为林下参与栽培参的特异鉴定方法。