自动化磁珠法提取血清脂溶性维生素应用LC-MS/MS检测的性能评价

目的评估自动化磁珠法提取血清脂溶性维生素应用液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)检测的性能。方法收集200例临床剩余血清样本,采用自动化磁珠法提取血清中脂溶性维生素A,D_(2),D_(3),E和K;同时联合LC-MS/MS检测脂溶性维生素A,D_(2),D_(3),E和K的线性、定量限、精密度、正确度、携带污染率等性能指标以及基质效应。并比较此方法与传统萃取法检测结果的一致性。结果自动化磁珠法提取脂溶性维生素A,D_(2),D_(3),E和K线性相关系数均>0.99;五种物质的定量限分别为5,0.25,0.25,125和0.025ng/ml;批内精密度和批间精密度分别为0.66%~4.83%,0.15%~3.70%;平均加标回收率为87.05%~111.11%;基质效应为95.43%~99.07%;高-低值样本循环进样结果均值与低-低值样本循环进样结果均值之差,均小于低-低值样本循环进样结果均值的3s;统计学结果显示自动化磁珠法和传统萃取法提取的脂溶性维生素结果相关性良好(r>0.99),两种方法的检测结果无显著偏倚。结论自动化磁珠法提取脂溶性维生素的检测性能良好,有望提高样品通量和分析效率。

不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。

基于微通道多向阀自动化快速提取DNA的研究

核酸的高效分离与纯化对于下游分子诊断具有至关重要的影响.本研究基于磁珠法提取原理设计出快速、自动化核酸提取系统,利用步进电机和注射泵组成的移液装置通过微通道连接多向电磁阀完成核酸裂解、洗涤、洗脱、纯化,通过大鼠主动脉内皮细胞进行核酸提取和扩增,对核酸加热裂解时间进行优化.结果表明,当裂解时间大于4 min时,核酸纯化效果最好,磁珠回收率可达96.5%,紫外吸收光比值大于1.8,同时整个自动化提取仅需8 min.通过微通道多向阀与核酸提取技术纯化后的核酸可直接用于扩增实验,且与手动提取相比聚合酶链式反应的Ct值起跳更早,有利于后续集成核酸检测一体化系统.

自动化磁珠法前处理在液相色谱串联质谱检测血浆儿茶酚胺及其代谢物中的应用

目的探讨自动化磁珠法前处理在液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测血浆儿茶酚胺及其代谢物中的应用效果。方法采用自动化磁珠法提取血浆标本中的儿茶酚胺[去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA)]及其代谢物[甲氧基去甲肾上腺素(NMN)、甲氧基肾上腺素(MN)、3-甲氧酪胺(3-MT)],并采用LC-MS/MS检测,分析该检测方法的线性、准确度、精密度及基质效应(ME)等性能。结果NE、E、DA、NMN、MN、3-MT检测的线性相关系数r2均>0.99,各浓度值与标准值偏差范围为0%~14.84%,均<15%。NE、E、DA、NMN、MN、3-MT的低、中、高值质控品批内变异系数(CV)为0%~13.480%,批间CV为1.260%~13.590%,符合批内、批间CV均≤15%的要求。NE、E、DA、NMN、MN、3-MT的ME均在-20%~20%范围内,说明ME影响较小。结论LC-MS/MS检测儿茶酚胺及其代谢物采用自动化磁珠法进行血浆标本前处理,各指标检测的线性、准确度、精密度及ME均符合行业标准。

磁珠法提取新型冠状病毒核酸的稳定性

目的探索磁珠法提取新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸及其与试剂混合后的稳定性。方法将国家卫生健康委员会临床检验中心(NCCL)和四川省临床检验中心(SPCCL)提供的32份SARS-CoV-2室间质量评价(EQA)样本分为4组,每组含3份NCCL样本和5份SPCCL样本。所有样本均采用磁珠法提取核酸,得到的核酸采用实时荧光逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法立即检测1次(靶基因为ORF1ab基因和N基因),即为各样本的初始结果。各样本余下的核酸按以下方式处理:第1组和第2组样本的核酸分别于4℃和20℃保存,在第6、12、18、24天各检测1次并记录结果;第3组和第4组样本的核酸与扩增试剂混合组成反应体系,再分别于4℃和20℃保存,在第4、8、16小时各检测1次并记录结果。所有结果用循环阈值(即Ct值)表示。核酸保存后的各次检测结果与其初始结果进行比较。结果磁珠法提取SARS-CoV-2核酸于4℃和20℃保存24 d内各次检测结果与初始结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05);磁珠法提取SARS-CoV-2核酸与扩增试剂混合后,于4℃和20℃保存16 h内各次检测结果与初始结果比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论4℃或20℃保存条件下,磁珠法提取SARS-CoV-2核酸至少可以稳定24 d,与试剂混合后至少可以稳定16 h。

核酸提取用磁珠粒度快速测试方法

为快速、准确地对核酸提取用磁珠的粒度进行测试,研究使用激光衍射粒度分析技术进行粒度试验,考察搅拌速度、超声频率、样品浓度(遮光度)的影响,并采用扫描电子显微镜进行方法准确度的确认,进行耐用性、时间稳定性、重复性、中间精密度的验证。同时,选取不同粒度的实际样品进行测定,结果表明,该方法的重复性优于3%,中间精密度优于5%。由此可见,该方法准确、可靠、快速、便捷,适用于核酸提取用磁珠粒度和粒度分布的测试。

微量苔藓样品提取实验方案改良

苔藓植物个体微小,为得到一种适于苔藓微量样品使用的DNA提取方案,首先对前人提取植物DNA的方法进行了筛选;其次对所选择的3种适于提取苔藓样品DNA的方法——CTAB法、尿素法和磁珠法进行了改良;最后通过使用上述3种改良方法对牛角藓Cratoneuron filicinum植物样品总DNA进行提取,并比较了提取效果、提取时间和费用.结果显示:3种改良方法均可从2mg干燥牛角藓材料中提取总DNA并得到阳性PCR结果.其中,改良磁珠法提取的DNA浓度较高,提取过程时间短,但成本高于其他2种方法.改良CTAB法提取的DNA浓度低于磁珠法,且实验耗时长,但DNA纯度较高,且实验成本仅为磁珠法的5%.PCR实验显示改良磁珠法与改良CTAB法的扩增成功率均为100%,而改良尿素法的扩增成功率仅为75%.认为改良磁珠法与改良CTAB法均可作为微量苔藓样品DNA提取的优选方案.

细胞裂解法和磁珠法在法医DNA检验中的对比

目的比较细胞裂解法和磁珠法在法医DNA检验中的效果,探讨两种方法在法医学检验中的运用。方法使用细胞裂解法和磁珠法获取不同数量的THP-1细胞的基因组DNA并使用实时定量PCR检测DNA含量。使用细胞裂解法和磁珠法对不同稀释倍数的人血进行STR分型检测。结果当THP-1细胞数量为100、400和800个时,使用细胞裂解法提取的DNA含量分别为(1.219±0.334)、(5.081±0.335)、(9.332±0.318)ng;使用磁珠法提取的DNA含量分别为(1.020±0.281)、(3.634±0.482)、(7.896±0.759)ng,在THP-1细胞数量为400和800个时,细胞裂解法提取的DNA含量高于磁珠法(P<0.05)。使用细胞裂解法和磁珠法检测不同稀释倍数人血的STR分型时灵敏度相近,在血样稀释100、300和500倍时均能获取完整的STR分型,血样稀释700倍时,均无法检出完整STR分型。使用细胞裂解法无法检出未稀释人血的STR分型。结论细胞裂解法操作方便,能最大程度保留模板DNA,有望适用于微量血痕检验。

一种适用于高通量基因分型的水稻种子切片DNA制备技术

建立一种高质量、低成本的水稻种子切片DNA制备方法,用于育种群体的高通量基因分型。通过对比TPS法提取水稻叶片DNA及96孔板结合磁珠法提取切片种子DNA的纯度和浓度,进一步采用STARP(Semi-thermal asymmetric PCR)标记检测验证96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA的质量。结果表明:96孔板结合磁珠法提取水稻种子切片的DNA质量和纯度优于TPS法提取水稻叶片的DNA质量;STARP标记检测验证结果显示96孔板结合磁珠法提取水稻切片种子DNA可适用于GS3、Wx的STARP标记基因分型,其鉴定结果与测序结果一致。研究显示96孔板结合磁珠法可以从微量水稻种子切片中提出高回收率、高纯度、高完整度、无PCR抑制物的DNA用于高通量STATP法基因单倍型分析,可获得一种96孔板结合磁珠法提取DNA的高通量基因分型操作流程。

磁适配体生物传感器

磁珠(magnetic beads,MBs)是具有磁性的微小球形颗粒,在将分析物从复杂基质中分离出来以及固定配体等方面发挥关键作用。为了获得不同的识别及信号输出性能,MBs可以与各种反应基团进行功能化并发挥相应作用。对磁珠的性质、制备方法、功能化改性与搭载适配体的应用等方面进行了全面综述,总结了磁生物传感器所表现出的准确性、及时性、便携性、低成本,及在痕量水平上的信号放大等优势。最后,提出了磁珠潜在的应用挑战和未来方向。

基于风险矩阵法的磁力珠类玩具质量安全风险评估

磁力珠是近几年市场上出现的一种新兴玩具,因可塑造性及可玩性强而备受欢迎,但随之而来的安全伤害事故也持续发生,因此对磁力珠类玩具进行质量安全风险评估至关重要。本文在磁力珠类玩具问卷、采样分析及现场调研的基础上,建立磁力珠类玩具质量安全风险指标体系,并采用风险矩阵模型对磁力珠类玩具进行风险评估,识别出9个高风险选项并提出对策建议,对磁力珠类玩具的质量安全防控对策具有较强的实践意义。

磁珠快速核酸提取法在南美白对虾病原检测中的应用及其性能评价

为实现南美白对虾相关病原核酸快速、便捷提取,并实现原材料国产化,降低成本,建立了一种基于国产磁珠的核酸快速提取方法(以下简称磁珠法).以携带虾肝肠胞虫的南美白对虾为实验样本,通过微流控芯片对3种磁珠提取的核酸进行测试,并对裂解液中盐酸胍浓度及洗涤液2中乙醇浓度进行了优化.通过优选实验确定:奥润磁珠提取效果优于其他两种磁珠;裂解液中盐酸胍的最佳浓度为4 mol·L^(-1);洗涤液2中乙醇的最佳质量分数为75%.在此基础上,分析评价了优化后的磁珠法核酸提取线性范围、灵敏度、精密度、特异性及抗干扰能力等技术性能.结果显示:稀释10^(4)倍后的低浓度病原核酸仍保持较好的扩增效果,变异系数为2.03%,表明建立的磁珠法具有较宽的检测范围,灵敏度高,特异性和抗干扰能力强.本文建立的磁珠法可实现快捷、通用、高纯度、低成本的南美白对虾主要病原的核酸提取.

基于核酸适配体-磁珠的猪血IgG提取方法研究

目的:建立基于核酸适配体-磁珠的猪血IgG快速提取方法。方法:采用人工合成的IgG脱氧核糖核酸适配体与羧基修饰的磁珠进行偶联,采用单因素实验分别优化血浆与核酸适配体-磁珠体积比、作用时间、洗脱液NaCl浓度等因素;采用正交分析确定上述单因素的最佳组合,进而建立猪血IgG提取的最佳条件。结果:IgG优化提取条件为:血浆与核酸适配体-磁珠体积比为100:1,洗脱液NaCl浓度为1.5 mol/L,反应时间为2 h。在此最佳条件下,IgG的提取收率为91%。结论:成功建立一种新型高效的猪血IgG提取方法,该方法具有快速、收率高、条件温和、不使用有机溶剂等优点。

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的（CA）15寡核苷酸探针从波纹唇鱼（Cheilinusundulatus）基因组DNABspl43I酶切位点的400～1000bp片段中筛选CA／GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18．T载体上构建富集微卫星基因组丈库后，通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点，阳性序列比例达到73．33％。其中完美型（perfect）类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中，共有28条r31．82％）微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选，其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析，其中4对引物扩增产物为单态，20对扩增产物呈多态性；20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2～12，平均有效等位基因数为3．5。该波纹唇鱼群体的P／C、Ho，He的平均值分别为0．0782、0．8513、0．5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。

天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究

为了开展天牛科昆虫分子系统学研究,采用酚-氯仿提取法、TakaraDNA快速提取试剂盒及GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒3种方法分别对75%乙醇常温保存、无水乙醇-20℃冷藏保存和活体4℃保存3种保存方式且保存时间1年以上的松墨天牛幼虫进行DNA提取,并对不同提取方法所获取的DNA纯度与质量进行分析比较,确定了长时间保存天牛幼虫以无水乙醇浸渍-20℃冷藏保存效果最佳,而用GenMagBio磁珠法提取试剂盒提取DNA出现降解的标本提取效果最好。应用GenMagBio磁珠提取试剂盒对实验室保存多年的天牛幼虫标本进行DNA提取,并对提取DNA是否适合后续的PCR扩增及DNA序列测定进行了实验验证,结果符合预期。

藏酋猴毛干DNA的3种提取方法

为寻求一种从藏酋猴毛干中提取总DNA的有效方法,从一藏酋猴个体背部剪取数量不等的毛干样品(不含毛囊),经蛋白酶K消化后,分别采用高盐沉淀抽提法、酚氯仿抽提法、纳米磁珠抽提法分离获得用于PCR扩增的模板DNA,通过紫外分光光度计测定OD值并计算出质量浓度,同时进行琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测,分析3种方法提取藏酋猴毛干DNA的质量差异。每处理设置10个重复。结果表明,纳米磁珠法提取藏酋猴毛干中DNA是一种快捷、简便、经济、高效、安全的有效方法;进行毛发取样时以5～10根较为合适。

云斑尖塘鳢微卫星分子标记的筛选与检测

用磁珠富集法分离云斑尖塘鳢的微卫星序列,由所获得的1032个克隆中筛选出146个阳性克隆,经测序81个含有微卫星序列,52个为完美型,27个为非完美型,2个为复合型,其中43个微卫星序列重复次数在10以上。所获得的云斑尖塘鳢微卫星序列中除探针中使用的CA重复单元和GA重复单元外,还有TAC等其他类型的重复单元。设计合成38对微卫星引物,其中29对引物可稳定扩增出条带,使用这些引物对云斑尖塘鳢48个个体进行检测显示:观测杂合度平均值为0.63,期望杂合度平均值为0.43。29对引物中1对引物表现为单态,7对表现为高度多态,14对表现为中度多态,7对表现为低度多态,多态性较为丰富,说明本研究开发的绝大部分微卫星分子标记较为理想。

DNA数据库建设中批量样本直接扩增检验法的应用

目的研究批量样本直接扩增法在DNA数据库建设中的应用。方法打孔机打取血滤纸600份,剪取芝麻大小的口腔拭子300份,放入96孔扩增板,加入扩增试剂后直接扩增,并对其中200份血滤纸用磁珠法,100份口腔拭子用96孔板Chelex-100法,经DNA提取后扩增检验进行比较。结果血滤纸采用直接扩增法及磁珠法STR检测成功率均为100%;口腔拭子采用直接扩增法的成功率为95%,采用96孔板Chelex-100法的成功率为94%。结论血滤纸和口腔拭子通过直接扩增均能获得很好的DNA分型结果,该方法省时省力,可用于DNA数据库建设。

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的比较TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒(HCV)RNA定量检测结果的影响。方法收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息。分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCV RNA,qPCR检测提取HCV RNA的病毒载量,分析两种提取方法所得HCV RNA检测结果的差异。结果 qPCR结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性:y=0.978x+0.063(R2=0.973)。Bland-Altman统计分析显示TRIzol法提取的HCV RNA病毒载量对数值的平均值略低于磁珠法,但差异无统计学意义(P>0.05)。基因型分析结果显示1a、1b、2a、3a和6a基因型中两种提取方法差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 TRIzol法提取HCV RNA的定量检测结果和磁珠法相当,且成本低廉,可在国内广泛用于试剂盒的开发和HCV RNA临床检测。

DNA数据库建设中批量样品不同DNA提取方法的比较

目的比较和选择自动化工作平台提取DNA的方法,并用于DNA数据库建设。方法用手工Chelex-100法、Biomek3000自动化工作平台结合Chelex-100法及DNA-IQTM磁珠法对实验室收集的建库滤纸血样进行DNA提取,荧光定量技术对上述3种方法提取的模板DNA进行测定;扩增产物用3100基因分析仪检测并用基因分析软件分析。结果手工Chelex-100法、自动化Chelex-100法及DNA-IQTM磁珠法提取的DNA模板浓度分别为0.593ng±0.131ng/μl、0.579ng±0.096ng/μl、0.447ng±0.056ng/μl;成功率分别为100%、98.9%、99.5%。结论本文建立的自动化Chelex-100法可用于大规模DNA数据库建设。