DNMT3b基因在骨髓瘤RPMI 8226细胞株中的表达及其生物学意义

目的:研究多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226中DNMT3b基因的表达情况并分析其生物学意义。方法:ELISA方法检测RPMI 8226中DNA甲基转移酶的活性;半定量RT-PCR及实时荧光定量PCR方法检测RPMI 8226细胞中DNMT3b基因mRNA的表达;不同浓度地西他滨干预RPMI8226细胞24 h后观察细胞增殖及DNMT3b基因mRNA表达水平的变化。结果:RPMI8226细胞中DNMT活性升高,DNMT3b基因mRNA表达水平升高。不同浓度地西他滨干预24 h后RPMI8226细胞增殖抑制,发生凋亡,DNMT3b基因mRNA表达水平降低。结论:骨髓瘤RPMI8226细胞中DNMT3b基因表达水平升高,地西他滨可能通过抑制DNMT3b表达从而抑制RPMI8226细胞增殖并诱导其凋亡。因此,DNMT3b有望作为骨髓瘤治疗的新靶点。

血液系统条件性DNMT3B基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的构建可在血液系统中条件性敲除DNMT3B基因小鼠并进行鉴定,为研究DNMT3B基因的生物学功能及其在血液肿瘤疾病的作用机制提供动物模型。方法将引进的DNMT3B^(flox/flox)小鼠与Mx1-Cre^+小鼠进行杂交繁殖,得到基因型DNMT3B^(flox/+)Mx1-Cre^+及DNMT3B^(flox/+)Mx1-Cre^-两种子代,再用这两种子代杂交产生子代小鼠,通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型;获得基因型为DNMT3B^(flox/flox )Mx1-Cre^+的小鼠,通过腹腔注射p I-p C共5次诱导DNMT3B敲除,然后用半定量PCR方法鉴定DNMT3B基因敲除情况。结果基因型鉴定确认在13只子鼠中有2只为DNMT3B^(flox/flox) Mx1-Cre^+,经p I-p C腹腔注射后,DNMT3B基因通过Cre/lox P系统被成功敲除。结论该方法成功构建可以在血液系统条件性敲除DNMT3B基因的小鼠,并进行敲除后鉴定。

反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体联合转染对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞株QBC-939的增殖能力和细胞凋亡的影响。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将二者先后转染入QBC-939,经G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株,并用Western blot检测转染前后的蛋白表达变化;用MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞生长周期及凋亡率的变化。结果Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,并以前者为甚;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为(6.78±0.89)%和(14.86±2.13)%,明显低于未转染组;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从(1.63±0.27)%分别增加到(18.47±1.46)%和(6.19±0.78)%;在上述效应检测中,单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DNMT1反义基因;在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,二者通过甲基化途径对胆管癌的发生发挥作用。

甲基化酶DNMT3B基因敲除的CHO-K1细胞系构建

构建敲除DNMT3B基因的细胞系,为重组蛋白药物生产使用的高效表达系统提供DNMT3B基因缺失的稳定细胞株.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建敲除DNMT3B基因的质粒,并利用脂质体转染CHO-K1细胞进行基因编辑、T7E1核酸内酶切及筛选DNMT3B基因敲除细胞,以及软琼脂法获得单克隆.结果表明,通过对获得的单细胞克隆进行测序比对,确定DNMT3B基因第4个外显子处被编辑产生移码突变.最终获得DNMT3B基因特异位点删除的CHO细胞单克隆.

不同类型结直肠癌前病变患者血浆Septin9基因甲基化水平及病变组织CEA、DNMT3b蛋白的表达

目的:分析不同类型结直肠癌前病变患者血浆Septin9基因甲基化水平及病变组织CEA、DNMT3b蛋白的表达水平。方法:选取114例结直肠癌前病变患者为研究对象,均行肠镜和病理检查,并检测血浆Septin9甲基化水平和病变组织CEA、DNMT3b蛋白水平,比较不同类型结直肠癌前病变患者血浆Septin9甲基化水平和病变组织CEA、DNMT3b蛋白的表达水平。结果:肠镜和病理检查结果显示,114例结直肠癌前病变患者中,结直肠腺瘤43例,腺瘤病30例,炎症性肠病相关异型增生41例;腺瘤病患者血浆Septin9基因甲基化水平及病变组织CEA、DNMT3b蛋白相对表达量均高于腺瘤及炎症性肠病相关异型增生患者,且腺瘤患者高于炎症性肠病相关异型增生患者,差异有统计学意义(P<0.05);结直肠癌前病变组织中CEA与DNMT3b蛋白均呈高表达,尤以腺瘤病患者最为明显,CEA蛋白表达部位以细胞膜为主,DNMT3b蛋白表达部位以细胞质为主。结论:不同类型结直肠癌前病变患者血浆Septin9基因甲基化水平、病变组织CEA与DNMT3b蛋白相对表达量均存在差异,以腺瘤病患者最高,腺瘤患者次之,炎症性肠病相关异型增生患者最低。

乳腺癌MCF-7细胞的分子生物学特征

目的研究乳腺癌MCF-7细胞的分子生物学特征。方法采用甲基化特异性PCR(MSP),对MCF-7细胞进行Stratifin和CyclinD2基因甲基化检测;采用RT-PCR法,检测Stratifin、CyclinD2和Dnmt3b基因的mRNA表达。结果乳腺癌MCF-7细胞系中,Stratifin基因是非甲基化的,mRNA表达水平较高;CyclinD2基因完全甲基化,mRNA表达缺失;Dnmt3b基因呈明显表达。结论 Stratifin和CyclinD2基因的甲基化发生,可能下调其mRNA的转录表达,MCF-7细胞的这些分子生物学特性可为乳腺癌的表观遗传学研究提供一定的参考价值。

DNA甲基转移酶3b在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

目的:分析结直肠癌组织与癌旁正常组织中DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因的表达情况。方法:选取我院2015年20例结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR),分别检测组织中DNMT3b mRNA的表达量,同时分析其表达水平与年龄、性别及肿瘤TNM分期的联系。结果:结直肠癌组织DNMT3b mRNA的表达含量(2.912±1.174)高于癌旁正常组织(0.658±0.123)(P<0.05)。男性患者组织中DNMT3b的相对表达量(3.447±0.423)高于女性患者(3.082±0.301)(P<0.05)。结论:结直肠癌组织高表达DNMT3b基因,可能是肿瘤的发生和发展原因之一。

罕见ICF综合征1例临床表型和分子遗传学分析

目的探讨免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常(ICF)综合征的临床特征和遗传特点。方法回顾分析1例ICF综合征患儿的临床资料和基因检测结果。结果男性患儿,4岁,有反复感染;面部特征为圆脸、眼距稍宽、下颌尖、鼻梁稍扁、内眦赘皮明显、耳位低。免疫学检测示IgA缺如。基因测序发现患儿DNMT3B基因存在一个纯合错义突变c.2506G>A,父母为杂合携带者,确诊为ICF综合征I型。结论DNMT3B基因突变可引发ICF综合征,基因检测有助于提高此类罕见病的诊断。

下调受精卵中Clock基因对早期小鼠胚胎DNA甲基化的影响

目的通过干扰小鼠二细胞受精卵中节律基因Clock的表达，研究Clock对小鼠早期胚胎DNA甲基化的影响。方法将Clock基因的RNAi干扰质粒转染到通过人工授精得到的二细胞受精卵中，通过移植假孕雌鼠获得7．5～11．5dpc的小鼠胚胎，并检测其基因组DNA甲基化水平和甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b的表达。结果Clock干扰组无论是基因组DNA甲基化水平还是甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b的表达量均较对照组高（均P〈0．01）。结论降低小鼠受精卵中节律基因Clock的表达量，可以通过影响甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b而改变其胚胎发育中DNA甲基化水平。

携带DNMT3b-shRNA干扰序列真核表达载体的构建及筛选

目的:构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒。方法:以基因DNMT3bmRNA为靶序列设计三条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pG-ensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3b-shRNA2、pGensil-1-DNMT3b-shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T_(24)细胞中,应用RT-PCR和Western-blot检测各组质粒对DNMT3bmRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列。结果:各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT-PCR结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3bmRNA的抑制率分别为20.44%、79.91%和54.48%;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17.27%、77.74%和56.79%。结论:成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA(1,2,3),并筛选出pGensil-1-DNMT3b-shRNA2为沉默效应最强的质粒。

p53基因甲基化、DNMT3B基因多态性与燃煤型砷中毒关系研究

目的检测p53基因第五外显子＂CCGG＂序列第二个胞嘧啶（C）的甲基化状况,探讨p53基因在地方性砷中毒（地砷病）发生发展中的作用;同时检测DNA甲基化转移酶（DNA methytransferase,DNMT）DNMT3B基因启动子区-149位点C46359T单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）的情况,探讨DNMT3B启动子区-149位点SNP与地砷病易感性是否具有一定的关联。方法采用甲基化敏感性限制性内切酶（Methylation-sensitive restriction Endonuclease,MS-RE）-PCR法,检测118例砷中毒患者和126例正常对照p53基因第五外显子甲基化状况;采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR-RFLP）,检测123例砷中毒患者与126例正常对照DNMT3B启动子区-149位点SNP情况。结果 （1）p53基因第五外显子甲基化率砷中毒组为50.85%,对照组为88.89%,砷中毒组明显低于对照组（P〈0.01）;在砷中毒不同病情组,甲基化率均低于对照组,差异均有统计学意义（P〈0.01）,且随着病情加重,甲基化率有降低的趋势,但差异无统计学意义（P〉0.05）;（2）砷中毒人群DNMT3B启动子区CT杂合型频率为4.89%,TT纯合型频率为95.11%,未检出CC纯合型;对照组人群中DNMT3B启动子区CT杂和型频率为4.76%,TT纯合型频率为95.24%,未检出CC纯合型;该基因该多态位点基因型分布在砷中毒人群和对照组人群中差异无统计学意义（P〉0.05）;经性别、年龄校正,未发现-149多态位点不同基因型与罹患地砷病有关联OR=1.138（95%CI：0.309~4.198,P=0.846）;（3）根据文献报道的数据,将对照组人群与中国北部人群、美国白种人群、英国人群基因型分布进行比较,发现对照组人群与中国北部人群差异无统计学意义（P〉0.05）,与美国白人、英国人比较,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 （1）燃煤砷污染可致砷中毒组人群p53基因第五外显子低甲基化;（2）本次实验未观察到DNMT3B基因启动子区-149位点C46359T SNP与罹患地砷病存在关联;（3）对照组人群DNMT3B基因启动子区-149位点SNP与北方人群报道基因型分布一致,在该基因该位点SNP检测方面为中国人群基因库提供了基础数据。

DNMT3B基因启动子C46359T与燃煤型砷中毒关系探讨

目的:检测DNA甲基化转移酶(DNA methytransferase,DNMT)DNMT3B基因启动子区-149位点C46359T单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),探讨DNMT3B启动子区-149位点SNP与地砷病易感性是否具有一定的关联。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)。结果:(1)砷中毒人群DNMT3B启动子区CT杂合型频率为4.89%,TT纯合型频率为95.11%,未检出CC纯合型;对照组人群中DNMT3B启动子区CT杂合型频率为4.76%,TT纯合型频率为95.24%,未检出CC纯合型;该基因该多态位点基因型分布在砷中毒人群和对照组人群中差别无统计学意义(P>0.05);(2)根据文献报道的数据,将对照组人群与中国北部人群、美国白种人群、英国人群基因型分布进行比较,发现对照组人群与中国北部人群差别无统计学意义(P>0.05),对照组人群与美国白人、英国人比较,差别具有统计学意义(P<0.01)。结论:(1)本次实验未观察到DNMT3B基因启动子区-149位点C46359TSNP与罹患地砷病存在关联;(2)对照组人群DNMT3B基因启动子区-149位点SNP与北方人群报道基因型分布一致,在该基因该位点SNP检测方面为中国人群基因库提供了基础数据。

免疫缺陷-着丝粒不稳定-面部异常综合征研究进展

免疫缺陷-着丝粒不稳定-面部异常综合征,简称ICF综合征,是目前已知的唯一涉及DNA甲基化缺陷的人类遗传病,约50%的病例由DNMT3B基因复合杂合突变所致。全球已有百余病例,目前国内仅有数例报道,且不排除误诊及漏诊的可能,尚无中文文献系统性阐述该病,现综述ICF综合征可能涉及的发病机制、临床表现、遗传特征、治疗手段与预后,以提高国内医师对该病的认识。

罕见免疫缺陷着丝粒不稳定和面部异常综合征1型1例并文献复习

免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常(immunodefificiency with centromeric instability and facial anomalies,ICF)综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病,以轻重不同程度的免疫缺陷为特征,伴有面部异常和染色体着丝粒区不稳定,涉及的主要染色体为1、9和16号染色体。面部异常可包括圆脸、鼻梁扁平、上翘的鼻子、大舌和耳位偏低。大多数ICF患者有运动及语言发育迟缓,不同程度智力低下。其免疫学特征为:大多数患者患有低丙种球蛋白血症或无丙种球蛋白血症。