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鼠脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅱα)基因的克隆及原核表达
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作者 王卫芳 刘明远 +8 位作者 欧阳红生 吴秀萍 王学林 刘玛峰 杨勇 孙磊 王子见 张瑞 于艳玲 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期752-755,共4页
根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)基因设计引物,通过RT-PCR扩增出鼠DNaseⅡα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109。经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNaseⅡα基因序列完全一致,大小为1 008 bp。将重组质粒pMD-DNaseⅡ... 根据鼠脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)基因设计引物,通过RT-PCR扩增出鼠DNaseⅡα基因片段,克隆到pMD-18T载体,然后转化至大肠杆菌JM109。经鉴定及序列测定,克隆基因与鼠DNaseⅡα基因序列完全一致,大小为1 008 bp。将重组质粒pMD-DNaseⅡα进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经PCR和双酶切鉴定及序列分析正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,然后进行初步纯化,Western-blot鉴定。结果表明,本试验成功构建了pET-28a-DNaseⅡα表达载体;表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量约为38 800;初步纯化的目的蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带,Western-blot鉴定能与抗体发生特异免疫反应。 展开更多
关键词 脱氧核糖核酸酶(dnase ) 克隆 原核表达
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Effects of Nephrolithiasis on Serum DNase(Deoxyribonuclease Ⅰ and Ⅱ) Activity and E3 SUMO-Protein Ligase NSE2(NSMCE2) in Malaysian Individuals 被引量:1
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作者 Faridah Yusof Atheer Awad Mehde +3 位作者 Wesen Adel Mehdi Raha Ahmed Raus Hamid Ghazali Azlina Abd Rahman 《Biomedical and Environmental Sciences》 SCIE CAS CSCD 2015年第9期660-665,共6页
Objective Nephrolithiasis is one of the most common disorders of the urinary tract. The aim of this study was to examine a possible relationship between DNase Ⅰ/Ⅱ activity and E3 SUMO-protein ligase NSE2 in the sera... Objective Nephrolithiasis is one of the most common disorders of the urinary tract. The aim of this study was to examine a possible relationship between DNase Ⅰ/Ⅱ activity and E3 SUMO-protein ligase NSE2 in the sera of nephrolithiasis patients to evaluate the possibility of a new biomarker for evaluating kidney damage. Methods Sixty nephrolithiasis patients and 50 control patients were enrolled in a case-control study. Their blood urea, creatinine, protein levels and DNase Ⅰ/Ⅱ activity levels were measured by spectrometry. Serum NSMCE2 levels were measured by ELISA. Blood was collected from patients of the government health clinics in Kuantan-Pahang and fulfilled the inclusion criteria. Results The result indicated that mean levels of sera NSMCE2 have a significantly increase(P〈0.01) in patients compared to control group. Compared with control subjects, activities and specific activities of serum DNase Ⅰ and Ⅱ were significantly elevated in nephrolithiasis patients(P〈0.01). Conclusion This study suggests that an increase in serum concentrations of DNase Ⅰ/Ⅱ and E3 SUMO-protein ligase NSE2 level can be used as indicators for the diagnosis of kidney injury in patients with nephrolithiasis. 展开更多
关键词 Nephrolithiasis dnase dnase E3 SUMO-protein ligase NSE2 NSMCE2
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脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ)家族及其类似物的性质和研究现状
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作者 王卫芳 刘明远 《中国农学通报》 CSCD 北大核心 2009年第23期34-37,共4页
对DNase Ⅱ(脱氧核糖核酸酶Ⅱ)家族主要成员的特点以及研究现状进行了阐述,归纳了DNase Ⅱ的主要功能。了解DNase Ⅱ的性质及功能对于进一步研究DNase Ⅱ与细胞凋亡、疾病的发生、发展等的关系具有重要的意义。
关键词 脱氧核糖核酸酶 研究现状 细胞凋亡
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旋毛虫脱氧核糖核酸酶-Ⅱ酶活及酶活性位点的鉴定 被引量:3
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作者 吴秀萍 于录 +3 位作者 王学林 龙明慧 Boireau P 刘明远 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期209-213,共5页
以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证... 以旋毛虫新生幼虫期(NBL)脱氧核糖核酸酶-Ⅱ(DNaseⅡ)基因家族中全长序列T31D4为研究对象,对其融合蛋白的核酸酶活性进行鉴定并摸索最佳酶切条件;通过序列分析预测其关键活性氨基酸位点,同时利用基因点突变技术对所预测的位点进行验证。结果表明:旋毛虫的DNaseⅡ具有核酸酶酶切活性,最佳酶切pH为5.0,同时发现其在中性(pH 7.0)及偏碱性(pH 8.0)下仍具有活性。利用Maga2软件对包括旋毛虫在内的以及业已发现的来自38个物种的DNaseⅡ的94个氨基酸序列进行比对,发现一个所有物种DNaseⅡ均高度保守的组氨酸位点,该结果与目前国际上所预测的DNaseⅡ关键活性氨基酸位点不同,目前国际上所预测的组氨酸位点在旋毛虫的DNaseⅡ序列中并非组氨酸(H),而是丝氨酸(S)或赖氨酸(K);通过点突变技术进一步验证这个组氨酸位点才是所有物种DNaseⅡ真正的活性氨基酸位点。同时推测旋毛虫的DNaseⅡ可能为一种新类型的DNaseⅡ。 展开更多
关键词 旋毛虫 脱氧核糖核酸酶- 酶活性 活性位点
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旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的筛选和分析 被引量:3
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作者 李莲瑞 吴秀萍 +3 位作者 付宝权 卢强 王学林 刘明远 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期221-224,232,共5页
利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5cDNA作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选,并将阳性克隆全部送测序公司测序。对测序结果进行序列分析后,根据信号肽不同分为15种基因。NCBI BLAST检索表明,其中有13种基因均为旋毛虫未知基因序... 利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5cDNA作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选,并将阳性克隆全部送测序公司测序。对测序结果进行序列分析后,根据信号肽不同分为15种基因。NCBI BLAST检索表明,其中有13种基因均为旋毛虫未知基因序列,并且氨基酸序列最前面均包含有1个信号肽,属于分泌性蛋白。InterProScan检索表明,15种氨基酸序列均编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ),均含有DNaseⅡ的保守序列。通过互联网将编码蛋白序列输入CLUSTAL W数据库,检索结果表明,这些编码的脱氧核糖核酸酶Ⅱ蛋白质同源性高达85%-98%。 展开更多
关键词 旋毛虫 新生幼虫 脱氧核糖核酸酶基因家族
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旋毛虫新生幼虫期特异性基因N10的表达及鉴定
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作者 高长玲 刘明远 +6 位作者 郭恒 孙树民 付宝权 崔国祯 卢强 陈启军 P.Boireau 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期284-287,共4页
根据旋毛虫新生幼虫期特异性基因pBK-CMV-N10序列设计引物,利用PCR技术将基因N10的信号肽去除后,用T/A法克隆到pMD-18T载体,转化至大肠杆菌NovaBlue,经鉴定及序列测定,结果显示成功克隆到N10基因。将重组质粒pMD-18T-N10进行酶切后连接... 根据旋毛虫新生幼虫期特异性基因pBK-CMV-N10序列设计引物,利用PCR技术将基因N10的信号肽去除后,用T/A法克隆到pMD-18T载体,转化至大肠杆菌NovaBlue,经鉴定及序列测定,结果显示成功克隆到N10基因。将重组质粒pMD-18T-N10进行酶切后连接到原核表达载体pET-28a中,重组质粒经鉴定后转化大肠杆菌BL21star(DE3),用IPTG诱导表达出与理论相符的融合蛋白,相对分子质量为38700,诱导4h的表达量占菌体总蛋白量的15%。从N10重组蛋白提取可溶性融合蛋白,对其生物学特性初步鉴定结果表明,具有类似脱氧核糖核酸酶的活性。 展开更多
关键词 旋毛虫 新生幼虫 基因N10 表达 脱氧核糖核酸酶
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旋毛虫成虫DNaseⅡ—T3223-7基因的克隆及其表达特性鉴定 被引量:2
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作者 王安琪 丁静 +5 位作者 王楠 王兆国 胡晓祥 吴秀萍 刘明远 廖成水 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期87-91,共5页
利用RT-PCR技术从旋毛虫成虫得到T3223-7基因,并进行扩增克隆到原核克隆载体pMD18-T中,将重组质粒转入克隆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定,连接至pET-28a表达载体,最后转入表达菌Rosetta(DE3)。用1mmol/L IPTG诱导培养重组表达菌,... 利用RT-PCR技术从旋毛虫成虫得到T3223-7基因,并进行扩增克隆到原核克隆载体pMD18-T中,将重组质粒转入克隆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定,连接至pET-28a表达载体,最后转入表达菌Rosetta(DE3)。用1mmol/L IPTG诱导培养重组表达菌,对菌体裂解物进行SDS-PAGE分析,发现重组蛋白以包涵体的形式表达,约为40 000,与理论值相符。将纯化后的重组蛋白免疫家兔,制备兔抗T3223-7蛋白多克隆抗体,间接ELISA测定多抗效价达1∶320 000,Western blot检测表明制备的多克隆抗体能与T3223-7抗原发生特异性反应,并能识别和结合旋毛虫成虫排泄分泌物(ES)。 展开更多
关键词 旋毛虫 原核表达 多克隆抗体 dnase
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