人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达

目的 :克隆人DOC 2氨基端PID结构域 (暂命名为nDOC 2 ) ,并在原核细胞中表达。方法 :用RT PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC 2基因 ,并克隆到载体 pUC 19中。经测序证实后 ,用BamHI/EcoRI双酶切 ,亚克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1,并转化E .coliDH5α菌株。取工程菌 ,用IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE鉴定。结果 :①经RT PCR、测序和酶切鉴定 ,成功地克隆了人nDOC 2基因。②经IPTG诱导的重组质粒pGEX 4T nDOC 2表达出相对分子质量 (Mr)约为 5 0 0 0 0的融合蛋白 ,与预期的结果相符。结论 :成功克隆到人DOC 2氨基端PID结构域 ,并在E .coliDH5α中表达出GST nDOC

兔抗人DOC-2抗血清的制备与鉴定

目的 利用大肠杆菌中表达的融合蛋白GST nDOC 2 ,制备兔抗DOC 2的多克隆抗体。方法 将克隆有人DOC 2氨基端PID结构域 (暂命名为nDOC 2 )的原核表达载体pGEX 4T nDOC 2转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达融合蛋白GST nDOC 2 ,经包涵体洗涤后 ,用其免疫兔 ,制备兔抗人DOC 2抗血清。并以ELISA、Westernblot和免疫组化的方法对抗血清进行鉴定。结果 用ELISA法测定抗血清的效价为 1∶32 0 0 0 ;Westernblot结果显示对应于GST nDOC 2融合蛋白位置上有阳性条带 ;免疫组化结果显示人正常卵巢上皮细胞胞浆呈阳性染色 ,人卵巢浆液性囊腺瘤上皮细胞染色呈弱阳性 ,而人卵巢癌浆液性囊腺癌上皮细胞呈阴性染色。结论 成功制备了兔抗人DOC 2抗血清 ,为研究DOC

肿瘤抑制基因DOC-2真核表达载体的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达鉴定

目的构建肿瘤抑制基因DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,将其转入人卵巢癌细胞系HO-8910中,对其基因表达进行相关检测,为进一步研究DOC-2的功能奠定基础。方法利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段,将其连接入真核表达载体pCDNA3.1,并通过酶切鉴定。用脂质体介导法将真核表达载体pCDNA3.1-p93转染HO-8910,通过G418筛选稳定表达克隆;用免疫组化法观察人DOC-2蛋白在HO-8910中的表达。结果构建了DOC-2的真核表达载体pCDNA3.1-p93,并通过酶切鉴定。免疫细胞化学结果显示pIRES2-EGFP-p93成功转入HO-8910中。结论成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-p93并在HO-8910中得到稳定表达,为研究DOC-2蛋白的功能奠定了基础。

抑癌基因DOC-2对卵巢癌细胞增殖的影响

目的:探讨抑癌基因DOC2对卵巢癌细胞系HO8910在生长代谢、超微结构及细胞周期等方面的影响及其作用机制。方法:实验分3组:卵巢癌细胞系HO8910、8910P93(转染并表达DOC2基因)、8910pcDNA3.1(转染空载体pcDNA3.1),通过细胞消化计数法和3HTdR掺入法分别测定3组细胞的生长曲线及DNA合成代谢情况;利用透射电镜对细胞的超微结构进行观察比较;最后利用流式细胞仪观察卵巢癌细胞转染前后细胞周期的变化。结果:8910P93在生长增殖及DNA合成方面均明显低于HO8910和8910pcDNA3.1(P<0.05),而后两者之间无明显差异;电镜结果显示,8910P93存在内质网扩张,线粒体空泡化,溶酶体增生,部分细胞可见染色质边集等凋亡前期改变;细胞周期检测结果显示,处于G1和G2期的8910P93细胞明显增多而S期细胞明显减少。结论:抑癌基因DOC2可通过改变卵巢癌细胞的形态及细胞周期而明显抑制细胞的增殖。

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的:获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域(PID)cDNA基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用。方法:PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段,克隆入诱饵载体pGBKT7,再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果:成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域(PID)酵母双杂交诱饵载体,该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性,对报告基因也没有激活作用。结论:我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白,以利于对DOC-2基因功能进行研究。

DOC-2/DAB2结合蛋白、caspase 8在皮肤基底细胞癌中的表达及作用机制

目的探讨DOC-2/DAB2结合蛋白(DAB2IP)、caspase 8在皮肤基底细胞癌(BCC)中的表达及作用机制。方法选取80例BCC患者和30例接受整形外科手术的健康者,分别取其BCC组织和正常皮肤组织,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DAB2IP mRNA的相对表达量,蛋白质印迹(Western blot)法检测DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量。将si-DAB2IP、si-NC通过脂质体转染至BCC细胞系TE-354.T,分别作为si-DAB2IP组和si-NC组,Western blot法检测细胞中DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量。结果BCC组织中DAB2IP mRNA的相对表达量明显低于正常皮肤组织(P﹤0.01),DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量均明显低于正常皮肤组织(P﹤0.01)。抑制DAB2IP基因的表达后,si-DAB2IP组细胞中DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量均明显低于si-NC组(P﹤0.01)。肿瘤直径≥1 cm、病理类型为浅表型BCC患者BCC组织中DAB2IP、caspase 8蛋白的相对表达量均高于肿瘤直径﹤1 cm、病理类型为浸润型患者(P﹤0.05)。Pearson相关分析结果表明,BCC组织中caspase 8的表达与DAB2IP的表达呈正相关(r=0.72,P﹤0.05)。结论caspase 8、DAB2IP在BCC组织中低表达,DAB2IP可能通过促进caspase 8的表达发挥抗肿瘤作用,靶向DAB2IP或可成为BCC治疗的新靶点。

大肠癌组织中DOC-2和c-Fos蛋白的表达

目的:探讨DOC-2和c-Fos在大肠癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测132例大肠癌组织及48例正常肠黏膜组织中DOC-2和c-Fos蛋白的表达情况。结果:大肠癌组织与正常肠黏膜组织中DOC-2的阳性表达率分别为31.1%(41/132)和81.2%(39/48),c-Fos的阳性表达率分别为56.1%(74/132)和12.5%(6/48),2组间差异均有统计学意义(χ2分别为35.911,27.051,P<0.001)。大肠癌组织中DOC-2的表达与患者年龄、性别、组织学类型、分化程度和临床分期无关(P>0.05),但与淋巴结及肝转移有关(P<0.05);c-Fos蛋白的表达与患者年龄、性别、组织学类型、临床分期、淋巴结及肝转移无关(P>0.05),但与分化程度有关(P<0.05)。大肠癌组织中DOC-2与c-Fos蛋白的表达呈负关联(rP=-0.368,P=0.001)。结论:DOC-2和c-Fos蛋白的异常表达可能在大肠癌的发生发展中起重要作用。

DOC-2对卵巢癌细胞HO-8910致瘤力的影响

背景与目的:作为近年发现的新的肿瘤抑制基因,DOC-2的作用机制还不完全清楚。本实验的目的在于观察DOC-2转染后对卵巢癌细胞系HO-8910在克隆形成率、细胞周期、裸鼠致瘤能力等方面的影响,并对其作用机制进行初步探讨。方法:实验分3组:卵巢癌细胞系HO-8910(无DOC-2基因的表达)、8910-P93(经转染并表达DOC-2基因)、8910-pcDNA3.1(转染空载体pcDNA3.1),首先通过软琼脂克隆形成实验比较3组细胞克隆形成率的差异,之后利用流式细胞仪观察其细胞周期的变化,最后用裸鼠荷瘤实验进一步验证DOC-2对肿瘤细胞致瘤能力的影响。结果:卵巢癌细胞系HO-8910在转染DOC-2后其克隆形成率明显降低,与转染前差异明显(P<0.05),同时G1和G2期细胞明显增多而S期细胞明显减少,移植瘤裸鼠荷瘤实验显示HO-8910-P93细胞在裸鼠体内生长缓慢,肿瘤体积及重量均明显低于对照组(P<0.05)。结论:DOC-2基因能明显抑制卵巢癌细胞系HO-8910的致瘤力。

DOC-2对卵巢癌细胞TC-1增殖的影响

目的 :研究DOC - 2对卵巢癌细胞TC - 1的影响。方法 :用脂质体介导的转染技术 ,将含有全长DOC - 2cDNA的真核表达重组质粒和空载体质粒 ,分别导入不表达DOC - 2的TC - 1细胞 ,观察细胞增殖能力的改变。结果 :共获得 10个DOC - 2转染克隆 (TC -p93)和 6个空载体克隆 (TC -pcDNA3.1) ;转染后细胞形态与TC - 1细胞无显著差别 ;TC -p93细胞生长明显比TC-pcDNA3.1和TC - 1细胞慢 ;TC -p93细胞形成集落数显著少于TC - 1与TC -pcDNA3.1细胞 ;TC -p93G1期细胞百分比高于TC - 1和TC -pcDNA3.1细胞。结论 :DOC - 2基因可明显抑制癌细胞生长 ,可作为卵巢癌基因治疗的目的基因之一。

DOC-2作用蛋白的筛选及与TGFβⅢ受体相互作用的初步验证

背景与目的:人卵巢癌差异表达基因DOC-2既是肿瘤抑制基因也是信号分子,参与细胞的生长分化过程。筛选DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID(nDOC-2)的相互作用蛋白并进行初步验证,为研究DOC-2的信号通路提供线索。方法:将含有人DOC-2氨基端PID结构域cDNA的片断插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母菌AH109并在其内表达,然后转化人胎脑cDNA文库,在营养缺陷培养基和X-α-半乳糖苷酶(X-α-gal)上进行阳性克隆的双重筛选,PCR扩增目的片段,测序,并进行生物学分析,寻找DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白。将DOC-2cDNA和TGFβⅢ受体cDNA共转染人卵巢癌细胞系HO-8910,利用免疫沉淀和Western Blot,对TGFβⅢ型受体是否能与DOC-2相互作用进行初步分析。结果:经扩增和筛选胎脑cDNA文库及序列分析,21个侯选阳性克隆中3个克隆为:APLP1、TGFβⅢ型受体的部分mRNA和PCDHGC3(protocadherin gammasubfamily C3)。免疫沉淀及Western blot结果显示,DOC-2与TGFβⅢ型受体相互作用后可形成蛋白复合物。结论:获得的3个基因编码的蛋白可能参与了DOC-2的信号转导,DOC-2与TGFβⅢ型受体可能存在互相作用,并通过TGFβⅢ型受体在TGFβ的信号通路中起作用。

DOC-2基因对卵巢癌细胞周期的影响

目的 :探讨DOC 2基因对卵巢癌细胞周期的影响。方法 :将卵巢癌细胞 (TC 1)和转染空载体的卵巢癌细胞 (TC pcDNA3 1)作为对照组 ,与转染DOC 2的卵巢癌细胞 (TC p93 )同时进行消化收集后 ,经流式细胞仪检测 ,对比各组间细胞周期的改变。结果 :TC 1细胞经DOC 2转染后 ,其受阻于G1期的细胞增多 ,同时S期细胞相应减少 ,而单纯转染空载体对细胞周期并不产生明显影响。结论 :DOC 2基因可改变卵巢癌细胞TC 1的细胞周期 。

Dab2/DOC-2基因的研究进展

Dab2/DOC-2是具有信号转导功能的磷蛋白,通过蛋白质的相互作用和蛋白磷酸化发挥作用,参与细胞内吞作用、血小板活化和T细胞功能调节等过程,并且与人体内皮细胞的形态发生有关。有研究表明,Dab2/DOC-2基因还和醛固酮的分泌有关。在肿瘤中,Dab2纯合子基因缺失时激活细胞抑癌机制,是抑癌基因的候选成员。Dab2/DOC-2还参与多种信号途径并发挥重要作用。

膀胱移行细胞癌中Dab2/DOC-2与GRB2表达的相关性及临床意义

目的探讨Dab2、GRB2在膀胱移行细胞癌中表达的临床意义及其相关性。方法应用免疫组织化学方法检测Dab2、GRB2在64例膀胱移行细胞癌中的表达,采用卡方检验分析两者表达与膀胱移行细胞癌临床病理学特征之间的关系。结果膀胱移行细胞癌中Dab2和GRB2阳性表达率分别是43.8%和81.3%,表达呈负相关(r=-0.383,P=0.002)。Dab2表达水平与肿瘤病理学分期有关,GRB2表达与肿瘤的病理学分级有关。结论Dab2、GRB2蛋白表达可作为判断膀胱移行细胞癌生物学行为的重要指标。

人CDK2-AP1(DOC-1)酵母双杂交诱饵质粒自激活作用鉴定

目的验证诱饵质粒pBD-DOC-1在酵母双杂交系统的自激活性及毒性作用,为应用酵母双杂交系统(yeasttwo-hybrid system)筛选与p12DOC-1/CDK2-AP1相互作用的蛋白建立实验基础。方法将诱饵质粒pBD-DOC-1转化到酵母细胞MAV203中,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活作用。同时利用对照质粒组筛选组氨酸(His)本底表达抑制剂3AT(3-氨基-1,2,4-三唑)的合适工作浓度。结果诱饵质粒pBD-DOC-1成功转化到酵母细胞MAV203中,对宿主酵母细胞无毒性,对报告基因无自激活作用。确定了组氨酸(His)本底表达抑制剂3AT(3-氨基-1,2,4-三唑)的合适工作浓度。结论诱饵质粒pBD-DOC-1可以用于酵母双杂交实验,为进一步运用酵母双杂交技术在人类组织cDNA文库中筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础。

真核表达载体pIRES2-EGFP-p93的构建及在卵巢癌细胞HO-8910中的表达

目的 :构建肿瘤抑制基因DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO - 8910中 ,并得到稳定表达。方法 :利用XhoI酶切含有p93cDNA的质粒得到p93cDNA基因片段 ,将其正向连接入真核表达载体pIRES2 -EGFP ,并通过酶切鉴定。用脂质体介导的方法 ,将真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93转染人卵巢癌细胞系HO - 8910 ,通过G4 18筛选稳定表达克隆 ;分别在荧光显微镜下及用免疫组化法观察人DOC - 2蛋白在卵巢癌细胞系HO - 8910中的表达。结果 :构建了DOC - 2的真核表达载体pIRES2 -EGFP -p93,并通过酶切鉴定。在荧光显微镜下 ,转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910发出绿色荧光 ,荧光全部集中于胞浆内。免疫细胞化学染色结果显示转染了pIRES2 -EGFP -p93的人卵巢癌细胞HO - 8910胞浆呈棕黄色 ,而转染空载体的细胞呈阴性染色。结论 :成功构建了真核表达载体转染了pIRES2 -EGFP -p93,并在人卵巢癌细胞系HO - 8910中稳定表达 ,为研究DOC -

MicroRNA-92a在胰腺癌中的表达及对肿瘤生长的影响

目的探讨人胰腺导管腺癌(PDAC)中microRNA-92a(miR-92a)的表达及对肿瘤细胞生长的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PDAC组织中miR-92a的表达水平;慢病毒转染PANC-1细胞构建miR-92a稳定敲除模型,克隆形成与流式细胞仪检测细胞增殖凋亡;通过裸鼠皮下种植瘤模型检测下调miR-92a表达对肿瘤体内生长的影响;PCR及Western blotting检测miR-92a下游靶点DOC-2/DAB2结合蛋白(DAB2IP)在体外培养细胞中的表达水平;免疫组织化学检测DAB2IP在移植瘤组织中的表达水平。结果 miR-92a在PDAC组织中表达水平高于癌旁组织(P <0.05);miR-92a高表达的胰PDAC者肿瘤体积较miR-92a低表达者更大(P <0.05);下调miR-92a的表达能够抑制胰腺癌PANC-1细胞体外增殖能力,促进细胞凋亡,并抑制PANC-1细胞裸鼠皮下种植瘤的生长;下调miR-92a表达提高了PANC-1细胞内DAB2IP的表达水平及移植瘤组织内DAB2IP的表达水平(P <0.05)。结论 miR-92a在胰腺癌中表达升高,下调miR-92a的表达能使DAB2IP的表达下调而发挥抗肿瘤生长作用。

卵巢癌差异表达基因2氨基端PID结构域相互作用蛋白的筛选

目的筛选人卵巢癌差异表达基因2(differentiallyexpressedinovariancancer2,DOC-2)氨基端磷酸酪氨酸作用结构域PID(nDOC-2)的相互作用蛋白质,为研究DOC-2作用的信号通路提供线索。方法将含有人DOC-2氨基端PID结构域cDNA的片段插入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母菌AH109并在其内表达,然后转化人胎脑cDNA文库,在营养缺陷培养基和X-α-半乳糖苷酶(X-α-gal)上进行双重筛选阳性克隆,PCR扩增出目的片段并测序,进行生物学分析,寻找与DOC-2氨基端PID结构域蛋白相互作用的蛋白质。结果经过扩增和筛选胎脑cDNA文库,排除假阳性克隆,得到21个侯选阳性克隆,其中3个克隆进行了序列分析,它们是Amyloidbeta(A4)precursor-likeprotein1(APLP1)、TGFβⅢ型受体的部分mRNA和protocadheringammasubfamilyC3(PCDHGC3)。结论获得的3个基因编码的蛋白可能参与了DOC-2的信号转导通路,为研究DOC-2在卵巢癌基因治疗中的作用提供了新的思路。

结直肠癌患者DAB2IP及NET-1的表达及诊断意义

目的探讨结直肠癌(CRC)患者DOC⁃2/DAB2相互作用蛋白(DAB2IP)与新四极体⁃1(NET⁃1)的表达水平,并分析在CRC中的诊断意义,为提高CRC的确诊率提供参考。方法选取河北北方学院附属第一医院收治的148例CRC患者癌症组织和76例正常黏膜组织,通过免疫组化法检测DAB2IP与NET⁃1的表达,分析CRC癌组织DAB2IP与NET⁃1表达的相关性,分析两因子表达情况与CRC临床病理参数的关系及临床诊断效能。结果CRC组织中DAB2IP的阳性表达率27.70%(41/148)低于正常组织96.05%(73/76)(P<0.05);CRC组织中NET⁃1的阳性表达率66.89%(99/148)高于正常组织10.53%(8/76)(P<0.05)。DAB2IP与NET⁃1的表达呈负相关(P<0.05)。DAB2IP的阳性表达与CRC患者的TNM分期、分化程度、淋巴结转移、血管浸润、浆膜浸润和肝转移有关(均P<0.05),与肿瘤的大小无关(P>0.05),NET⁃1阳性表达与CRC的TNM分期、淋巴结转移、血管浸润、浆膜浸润和肝转移有关(均P<0.05),与肿瘤的大小和分化程度无关(均P>0.05)。DAB2IP诊断CRC的灵敏度、特异度和准确度分别为72.30%(107/148)、96.05%(73/76)和80.36%(167/224),NET⁃1分别为66.89%(99/148)、89.47%(68/76)和74.55%(180/224),DAB2IP联合NET⁃1分别96.62%(143/148)、97.37%(74/76)和96.88%(217/224),与DAB2IP或NET⁃1相比,DAB2IP联合NET⁃1的灵敏度、特异度和准确度均较高。结论CRC组织中DAB2IP呈低表达,NET⁃1呈高表达,DAB2IP与NET⁃1表达呈负相关DAB2IP联合NET⁃1可能为CRC诊断提供依据。

结直肠癌组织中DAB2IP和ZEB1的表达及临床意义

目的探讨结直肠癌(CRC)组织中DOC-2/DAB2相互作用蛋白(DAB2IP)、转录因子E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)的表达水平及临床意义。方法选取124例CRC患者的CRC组织标本及其中40例患者的癌旁正常组织标本,采用免疫组织化学染色法检测CRC组织和癌旁正常组织中DAB2IP和ZEB1的表达情况,分析CRC组织中DAB2IP与ZEB1表达的相关性,并分析DAB2IP和ZEB1表达情况与CRC患者临床特征的关系。结果CRC组织中DAB2IP的阳性表达率为80.65%,低于癌旁正常组织的97.50%(P﹤0.05);CRC组织中ZEB1的阳性表达率为44.35%,高于癌旁正常组织的12.50%(P﹤0.05)。相关性分析结果显示,CRC组织中DAB2IP与ZEB1的表达呈负相关(r=-0.737,P﹤0.01)。不同性别、年龄、肿瘤部位的CRC患者CRC组织中DAB2IP和ZEB1的阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。低分化、有淋巴结转移的CRC患者CRC组织中DAB2IP的阳性表达率均低于中高分化、无淋巴结转移的患者(P﹤0.05);低分化、有淋巴结转移的CRC患者CRC组织中ZEB1的阳性表达率均高于中高分化、无淋巴结转移的患者(P﹤0.05)。结论CRC组织中DAB2IP表达水平降低,ZEB1表达水平升高,且CRC组织中DAB2IP和ZEB1的表达呈负相关,两者均与CRC的分化程度及淋巴结转移情况有关。