再生障碍性贫血患儿HLA-DRB1*15表达及其与免疫抑制治疗疗效的关系

本研究探讨再生障碍性贫血(AA)患儿HLA-DR基因表达情况及其与免疫抑制治疗疗效的关系,评价HLA-DRB1*15基因型检测的临床意义。采用SSP-PCR方法对40例(特发性33例,继发性7例)获得性AA儿童和107名正常对照人群进行HLA-DR位点基因检测,其中32例AA患儿接受了免疫抑制治疗(其中强化免疫抑制治疗24例,单纯CsA治疗8例),比较AA患儿和健康人群HLA-DR基因表达差异,观察AA儿童HLA-DRB1*15表达与免疫抑制治疗疗效、疾病复发的关系。结果显示,特发性AA患儿HLA-DRB1*15(+)率为51.5%(17/33),较正常对照人群(20.6%)显著增高(p<0.01),7例继发性AA患儿均为HLA-DRB1*15(-)。HLA-DRB1*15(+)组AA患儿经免疫抑制治疗后6个月有效率和完全缓解(CR)率分别为93.8%、87.5%,而在HLA-DRB1*15(-)组分别为56.3%和31.3%,两组比较差异均具有极显著意义(p<0.01)。5例复发患儿均为HLA-DRB1*15(+)。结论:AA患儿HLA-DRB1*15基因表达频率较正常人群显著增高,HLA-DRB1*15(+)AA患儿对免疫抑制治疗反应好,疾病完全缓解率高。

肾综合征出血热与HLA-DR基因多态性的关联

目的 探讨人类主要组织相容性复合体 -DR(HLA DR)基因多态性与肾综合征出血热 (HFRS)之间的关联性。方法 采用聚合酶链反应 -序列特异性引物 (PCR SSP)DNA分型技术对遵义地区汉族 3 9例HFRS患者和2 8例健康对照进行HLA DR基因分型。结果 HLA DRB3 基因频率在HFRS患者组较正常对照组明显增高 (RR =5 .0 4,χ2 =9 988,P <0 0 1) ;HLA DRB1 0 90 12基因频率较正常对照组明显降低 (RR =0 2 4,χ2 =7 2 16,P <0 0 1) ;其它等位基因频率在患者组与对照组间无显著性差异。结论 在遵义地区汉族人群中 ,肾综合征出血热可能与HLA DRB3 基因呈正相关 ,与HLA DRB1 0 90

HLA-DR、DQ基因多态性与遵义地区汉族流行性出血热相关性的研究

目的:探讨HLA-DR、DQ基因多态性与遵义地区汉族流行性出血热(EHF)的关联性。方法:采用群体研究方法,应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术对100例流行性出血热患者(患者组)和100例健康对照者(健康对照组)进行HLA-DR、DQ基因分型,比较其等位基因频率(GF),并计算其相对危险度(RR)。结果:EHF患者组HLA-DRB1*16基因频率较对照组明显增高(RR=3.58,χ2=4.916,P=0.0266<0.05);患者组HLA-DQ各等位基因频率与对照组比较差异无显著性。结论:研究提示在遵义地区汉族人群中,HLA-DRB1*16基因与EHF呈正相关,HLA-DRB1*16基因可能是EHF的易感基因。

人白细胞DR抗原基因与动脉粥样硬化性脑梗死关系的研究

目的探讨人白细胞DR抗原(HLA DR)基因与动脉粥样硬化性脑梗死(ABI)免疫遗传的相关性。方法采用聚合酶链反应和顺序特异性引物(PCR SSP)基因分析方法,对31例ABI患者及30名无血缘关系健康人的HLA DR部分等位基因及亚基因进行检测分析。结果ABI组HLA DR B1*0301等位基因相对危险度(RR)=5.6842,明显高于其他位点,差异有显著性(P<0.05);其他HLA DR B1*各等位基因未见异常。结论HLA DR B1*0301等位基因可能为北方汉族ABI患者的致病易感基因或与其他基因相连锁而共同致病。

HLA-DR基因与广西籍壮族IgA肾病相关性的研究

目的:探讨广西籍壮族IgA肾病(IgAN)与HLA-DR基因的相关性,并进行序列分析。方法:采用聚合酶链反应—序列特异性引物法(PCR-SSP)对25例广西籍壮族IgAN患者及50名正常对照的HLA-DR4、HLA-DR12基因频率进行检测,并测定等位基因序列。结果:壮族IgAN组HLA-DR4的基因频率高于对照组(P<0.05),HLA-DR4基因阳性组持续性镜下血尿伴蛋白尿的发生率高于阴性组(P<0.05)。1例IgAN患者的HLA-DRB1*04基因出现碱基对变异,149位A→G,临床表现为发作性肉眼血尿,病理类型为局灶节段性肾小球硬化。结论:1HLA-DR4基因可能是广西籍壮族IgAN的易感基因;2HLA-DR4基因与临床表现为持续性镜下血尿伴蛋白尿的广西籍壮族IgAN相关。

HLA-DR等位基因与中国人群肺结核关联性的Meta分析

目的应用Meta分析方法探讨中国人群HLA-DR基因多态性与肺结核易感性的关系。方法通过全面检索查找已发表的有关中国人群肺结核与HLA-DR基因关联性的文献。以肺结核组和健康对照组的HLA-DR等位基因型频数分布的比值比为统计量,采用RevMan5.0.13进行Meta分析。结果符合纳入标准的文献共7篇。Meta分析及敏感性分析发现,病例组和对照组DR4、DR16、DRB1*15和DRB1*13.2的合并比值比及其95%可信区间分别为1.64(1.08,2.50)、2.08(1.32,3.28)、2.94(1.34,6.49)和0.32(0.14,0.72)。结论 DR4和DR16可能是南方汉族人群的易感基因;DRB1*15可能是北方汉族人群肺结核的易感基因,DRB1*13.2可能是其保护基因。

HLA－DR4基因对γ干扰素治疗类风湿关节炎的影响

报道３３例类风湿性关节炎（ＲＡ）接受人基因重组干扰素γ治疗的疗效。其中１９例为ＨＬＡ－ＤＲ４阳性，１４例为ＨＬＡ－ＤＲ４阴性。两组的年龄、性别、病程和病期均无显著差异，前者有效率为２６．３％，后者为６４．３％，两组有显著差异（Ｐ＝０．０１３）。两组的副作用无差异。

成人隐匿性自身免疫性糖尿病与HLA-DQ、DR基因的关联性

探讨成人隐匿性自身免疫性糖尿病(LADA)与HLA-DQ、DR基因的关联性。方法用聚合酶链反应序列特异性引物(PCR-SSP)检测60例正常人、41例1型糖尿病人(TlDM)和39例LADA患者的HLA-DR、DQ基因频率。结果HLA-DR3、DR4、HLA-DQA10301、HLA-DQB10201与TlDM的易感性相关;HLA-DR15、HLA-DQB10601与TlDM的保护性相关。HLA-DR4、HLA-DQA10301、HLA-DQB10201与LADA的易感性相关,HLA-DQB10601的基因频率在LADA组中显著高于TlDM组(P<0.05)。结论不同的遗传背景可能是影响LADA和TlDM起病方式及病情进展的重要因素之一。

乌珠穆沁绵羊ABCD4基因点突变与多脊椎性状关联性分析

为研究ABCD4基因在乌珠穆沁羊群体中基因的多态性与脊椎数的关联,从339只乌珠穆沁绵羊采集静脉血提取DNA,并且通过DR成像检测技术将乌珠穆沁绵羊的胸椎数和腰椎数进行了统计,PCR技术和Sanger测序技术等方法对ABCD 4基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点分别是SNP1(Chr7:89387652,C>T)和SNP2(Chr7:89393414,G>A)进行了研究。结果表明,SNP1与SNP2位点的突变结果基本一致,统计变异位点基因型以及等位基因型在乌珠穆沁绵羊群体的分布,并与脊椎数进行关联分析。在339只乌珠穆沁绵羊群体中,通过DR成像检测技术,确定出有普通脊椎羊55只,多脊椎羊为284只,通过Sanger测序技术,确定有普通脊椎羊50只,多脊椎羊为289只。SNP1(89387652,C>T)和SNP2(89393414,G>A)位点所检测出基因型与DR检测的吻合率为87.32%。说明关联显著的ABCD4基因的SNPs位点SNP1(Chr7:89387652,C>T)和SNP2(Chr7:89393414,G>A)可以作为乌珠穆沁绵羊脊椎数变异的候选基因功能位点。

AF0.3启动子调控的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异杀伤作用

背景与目的:甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)启动子调控下的目的基因能在AFP阳性肝癌组织中特异性表达;嘌呤核苷磷酸化酶(Escherichiacolipurinenucleosidephosphorylase,PNP)/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(6-methylpurine-2-deoxyriboside,MeP-dR)自杀基因系统具有强杀瘤效应。本研究旨在探讨AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。方法:构建甲胎蛋白启动子AF0.3调控下PNP基因表达载体pAF0.3/PNP,导入AFP阳性肝癌细胞HepG2和阴性的肝癌细胞株SMMC7721,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的HepG2/0.3-PNP及SMMC7721/0.3-PNP细胞。RT-PCR检测二者在细胞中的表达。台盼蓝拒染法检测细胞增殖效应,MTT法和流式细胞仪检测两株细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)检测PNP基因产物活性。结果:不论有氧还是缺氧条件,HepG2/0.3-PNP对MeP-dR均较为敏感,SMMC7721/0.3-PNP则对MeP-dR完全不敏感。在任何一种条件下,HepG2/AF0.3-PNP在混合细胞中比例达25%后,就可致明显旁观者效应;而在同样条件下,SMMC7721/0.3-PNP不导致明显的旁观者效应。HPLC结果显示,pAF0.3/PNP在HepG2细胞中可以将MeP-dR转化为6-MP,但其在SMMC7721中则不具有转化活性。结论:AF0.3启动子调控下的PNP/MeP-dR系统对AFP阳性HepG2细胞有较好的杀伤作用。

HLA-DR基因与汉族寻常型天疱疮易感性及临床表型相关性的研究

目的 探讨HLA DR位点基因在寻常型天疱疮 (PV)易感性中的作用以及DR基因与PV临床表型的相关性。方法 用序列特异性引物 聚合酶链反应 (PCR SSP)方法 ,对 61例PV患者和 5 7例正常对照者进行了HLA DR等位基因的分型 ,并分析了DR基因在两组中的分布 ;对 5 6例临床资料完整的PV患者进行了临床特征与HLA DR基因相关性的研究。结果 与正常对照组比较 ,PV患者组DR4、DRB1 14 ( 14 0 1、 14 0 4、 14 0 5 )基因频率明显增高 (校正P值分别 <0 .0 5及 <0 .0 1) ;对DR4阳性样本的组内基因亚型分型结果发现 ,PV组中DRB1 0 40 3、DRB1 0 40 6频率显著增高 (校正P值 <0 .0 5 )。重度皮损的患者中HLA DR4频率较轻度患者显著增高 (P <0 .0 1) ;高抗体滴度组患者中DRB1 14频率比低滴度组患者显著增高 (P <0 .0 1)。女性患者中DR4基因频率较男性患者显著增高 (P <0 .0 5 )。结论 DR4、DRB1 14基因可能是PV的易感基因 ;DR4、DRB1 14基因可能是反映PV病情轻重的一种标志。

含rPB-DR启动子和TK基因的重组腺病毒的构建和鉴定

目的构建含rPB- DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为前列腺癌基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术,将rPB DR启动子连接至pBluescriptSK -TK上构建出pBluescriptSK -rPB- DR TK,再酶切出rPB -DR -TK目的片断,并将其连接至穿梭质粒pShuttle上。将构建好的pShuttle- rPB- DR -TK经PmeⅠ单切线性化后再以电穿孔法转化至E.coli.BJ5183AdEasy1内进行同源重组,抽提质粒经卡那抗性筛选及酶切鉴定正确的即为pAd- rPB- DR -TK,再经PacⅠ酶切回收后以脂质体法转染人胚肾293细胞,包装出完整腺病毒,然后大量扩增测定滴度,并行PCR鉴定。结果经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了包含rPB -DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒pAd rPB DR TK,包装、扩增后测病毒滴度为1.1×108TCID50/ml。结论成功构建出包含rPB DR启动子和TK自杀基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步前列腺癌基因治疗的研究中。

PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究

目的探讨新型嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤-2′-脱氧核糖核苷(PNP/MeP-dR)自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用。方法构建PNP基因真核表达载体pcDNA3.0/PNP,脂质体介导法将其导入HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定转染PNP基因的细胞株HepG2/PNP。采用台盼蓝拒染法测绘细胞生长曲线,MTT法和FCM检测细胞对MeP-dR的敏感性及旁观者效应,HPLC检测PNP酶活性。结果HepG2/PNP细胞对MeP-dR十分敏感,作用4d后MeP-dR对HepG2/PNP的IC50为4.5μmol/L,而100μmol/L的MeP-dR即可最大限度地杀死HepG2/PNP细胞。100μmol/L MeP-dR作用8d后,混合细胞中HepG2/PNP比例仅占5%即可导致所有细胞死亡。HPLC结果显示,PNP基因产物能够将MeP-dR转化为6-MP。结论PNP/MeP-dR系统对肝癌细胞的杀瘤效果明显优于传统的自杀基因系统。本研究为该系统应用于肝癌体内治疗打下基础。

乙型肝炎病毒感染临床结局与HLA-DR基因的相关性研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染临床结局与人类白细胞抗原DR(HLA-DR)基因间的相关性。方法:选择急性乙型肝炎(AHB)76例,慢性乙型肝炎(CHB)102例,乙肝后肝硬化(LC)38例,肝细胞癌(HCC)34例,用聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)检测HLA-DR基因型。结果:HLA-DR1基因型频率在LC和HCC组显著高于AHB组(χ2=8.495,P=0.004),较CHB组也显著升高(χ2=5.667,P=0.017);HLA-DR8基因型发生频率在CHB、LC和HCC三个HBV慢性感染组间无显著差异(P=0.034),而在AHB组显著低于HBV慢性感染组(χ2=8.830,P=0.003);HLA-DR13基因型频率在AHB组显著高于CHB组(χ2=26.876,P=0.000)及LC和HCC组(χ2=6.413,P=0.011),而LC和HCC组又高于CHB组(χc2=6.479,Pc=0.011)。结论:HLA-DR1基因型可能与HBV相关的肝硬化和肝细胞癌的发生有关,而HLA-DR8基因型则对HBV感染的慢性化有促进作用,HLA-DR13基因型可有助于HBV的清除,但在HLA-DR13阳性的HBV慢性感染者发生肝硬化和肝细胞癌的风险增加。

人DR5胞外区域克隆及在大肠埃希菌中表达

目的克隆人死亡受体5(DR5)cDNA的胞外区域(eDR5),构建原核重组表达载体pGEX-eDR5,使eDR5在大肠埃希菌中表达。方法采用RT-PCR(反转录PCR)方法从人肝癌细胞HepG2中获得eDR5,然后克隆到pMD19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段。经双酶切将目的基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1上,测序正确后,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达GST-eDR5融合蛋白,最后用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达量。结果重组克隆载体pMD-eDR5经测序鉴定序列正确。构建的融合表达载体pGEX-eDR5在大肠埃希菌中表达,可溶性目的蛋白占细菌总蛋白约19%。结论成功克隆了人DR5 cDNA的胞外区域,并在大肠埃希菌中表达。为下一步分离纯化人DR5重组蛋白,制作多克隆抗体提供基础依据。

福建汉族慢性粒细胞性白血病患者HLA-DRB1基因分析

目的 探讨HLA DRB1基因多态性与慢性粒细胞性白血病 (CML)的关联。 方法 聚合酶链反应 序列特异引物 (PCR SSP)方法对 33例CML患者 (实验组 )和 10 4例健康志愿者 (对照组 )的HLA DRB1基因进行分型并分析HLA DRB1基因在二组间的分布。 结果 与对照组相比 ,CML患者的HLA DRB1 0 9的基因频率明显增高 ,RR =3 14 ,χ2 =7 82 ,P <0 0 1,其他等位基因频率在实验组与对照组间差异无显著性。 结论 福建汉族人群中HLA DRB1 0 9与慢性粒细胞性白血病有关联。

乙型肝炎病毒X基因的蛋白产物对HLA-DR表达的效应

目的 了解HBVX基因蛋白产物对HLA -DR表达的效应。方法 用野生型HBVX基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒pWHXⅡ转染HepG 2细胞。用PCR、Southern印迹、ELISA及Western印迹等分析鉴定目的基因DNA片段与其在转染细胞中的表达产物HBVX蛋白。将带重组质粒pWHXⅡ的HepG 2细胞的和带有HBV全基因组的 2 2 15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测。结果 在转染的HepG 2细胞和 2 2 15细胞表面均清晰地显示有HLA -DR表达 ,而对照组即不带质粒或只带载体质粒的HepG 2细胞则用同法不能在其表面检出HLA -DR的存在。结论 证明HBVX蛋白能在无炎症和外界因素存在下 ,单独诱导HLA -DR的表达 ,提示HBVX蛋白有参与乙肝免疫反应机制的可能性。

DR-nm23基因慢病毒表达载体的构建及其在人结直肠癌SW620细胞中的表达

目的:构建DR-nm23基因慢病毒表达载体及建立DR-nm23基因稳定表达的人结直肠癌SW620细胞系,为DR-nm23基因功能研究奠定基础.方法:应用逆转录聚合酶链反应方法筛选无内源性DR-nm23基因表达的人结直肠癌细胞系.通过AgeⅠ酶切获得DR-nm23cDNA片段,并将其交换连接到慢病毒表达载体pGC-FU中.慢病毒表达质粒pGC-FU-DR-nm23-GFP和包装质粒共转染293T细胞,孔稀释法测定慢病毒滴度.获得重组的慢病毒,感染人结直肠癌SW620细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白及Westernblot检测DR-nm23在SW620细胞中的表达.结果:低转移性结直肠癌SW480、HT29细胞DR-nm23基因高表达,而高转移性SW620细胞不表达.重组慢病毒质粒pGC-FU-DR-nm23-GFP酶切鉴定结果与目的基因条带吻合,克隆测序结果与NCBI收录的DR-nm23基因序列(NM_002510)完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞,慢病毒滴度为2E+9TU/mL.收集慢病毒上清液感染SW620细胞,荧光显微镜下观察85%细胞表达绿色荧光.感染后SW620细胞DR-nm23稳定高表达.结论:成功构建了携带DR-nm23与GFP融合基因的慢病毒表达载体pGC-FU-DR-nm23-GFP,获得了DR-nm23基因稳定表达的结直肠癌SW620细胞系.该细胞系可作为研究DR-nm23基因功能研究的可靠细胞模型.

HLA-DR基因与乙型肝炎病毒慢性感染结局的相关性

目的探讨HLA-DR基因与乙型肝炎病毒慢性感染临床结局的相关性。方法选择乙型肝炎病毒慢性感染者,包括慢性乙型肝炎患者102例,HBV相关性肝硬化38例,HBV相关性肝癌患者34例,健康对照组为健康骨髓捐献者1383例,HLA-DR基因型用PCR-SSP法进行检测。结果HLA-DR1基因型频率在健康对照组和CHB组间无显著差异(Pc>0.05),LC、HCC组中HLA-DR1基因型频率明显高于CHB组(x2=5.667,P=0.017)及健康对照组(xc2=9.438,Pc=0.002);HLA-DR13基因在健康对照组与LC、HCC组间无显著差异(Pc>0.05),但CHB组中HLA-DR13基因型的频率明显低于与健康对照组(x2=2.764,P=0.096)和LC、HCC组(xc2=6.479,Pc=0.012)。在CHB、LC和HCC三组间HLA-DR12和HLA-DR15基因频率无显著差异(P>0.05),但HBV慢性感染者中HLA-DR12基因型频率高于健康对照组(x2=16.320,P=0.000),而HLA-DR15基因型频率则低于健康对照组(x2=8.452,P=0.004)。结论HLA-DR12和HLA-DR15基因可能分别是HBV感染慢性化的易感和拮抗因素,HLA-DR1基因可能与HBV慢性感染后肝硬化、肝癌等不良结局发生有关,HLA-DR13虽可能保护宿主不易形成HBV慢性感染,但HLA-DR13阳性的HBV慢性感染者却易于发生肝硬化或肝癌等不良结局。