DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将

基因枪法获得逆境诱导转录因子DREB1A转基因小麦的研究

以小麦品种H675 6和藁城 890 1作为基因枪转化的靶材料 ,取其护颖至雌雄蕊原基形成期的幼穗 ,用含逆境诱导转录因子DREB1A和bar基因的质粒pAHC2 5轰击胚性愈伤组织 ,在分别含有 5mg L和 1 0mg LBasta溶液的培养基上进行筛选。得到的抗性愈伤组织在不含Basta溶液的培养基上再生培养 ,获得 2 1 8棵再生植株。田间涂抹浓度为 1 0 0mg L的Basta溶液检测后 ,对抗性植株作PCR检测 ,获得 5 4棵再生植株。通过对其中 2 0株T1代的PCR和Southern杂交分析 ,已获得 1 4株含DREB1A和bar基因的转基因小麦植株 ,其中H675 61 3株 ,藁城 890 1 1株。

不同启动子调控的DREB1A基因对黄瓜的遗传转化

以黄瓜(CucumissativusL.)主栽品种长春密刺的子叶节为受体材料,采用农杆菌介导法,将分别由诱导型启动子rd29A和组成型启动子35S调控的转录因子DREB1A基因导入黄瓜,获得大量PCR阳性植株。统计结果表明:诱导型启动子rd29A调控的DREB1A基因抗性芽率和再生植株PCR阳性率明显高于组成型启动子35S。

转录因子DREB1A基因的克隆与植物表达载体的构建

根据GenBank中已发表的转录因子DREB1A基因的cDNA序列设计并合成了一对引物 ,通过RT PCR的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出DREB1A基因的全长cDNA片段。将其克隆到 pMD1 8T vector中。经测序证明该片段与GenBank上报道的序列具有 99.8%的同源性。 2个碱基的置换导致了一处氨基酸的差异 ,但这一氨基酸并不在基因的功能结构域上 ,推测其不会影响基因功能。以植物表达载体pBch为基础 ,构建了由组成型启动子 35S调控的DREB1A基因的植物表达载体pBDR35S 。

农杆菌介导的DREB1A基因转化多花黑麦草及其转化体系的优化

采用携带卡那霉素抗性基因nptII和GUS基因的ubiquitin启动子驱动的表达载体pBI121/DREB1A的根癌农杆菌AGL1,对多花黑麦草幼胚来源的胚性愈伤组织进行了遗传转化,并优化了各种影响因素。胚性愈伤组织经根癌农杆菌感染和共培养后,用50 mg/L巴龙霉素筛选抗性愈伤组织,待抗性愈伤组织在IB分化培养基上分化成苗后用25 mg/L卡那霉素进一步筛选再生植株,获得了部分抗性植株。抗性植株的总DNA用DREB1A基因的特异引物进行PCR检测,转化频率为2.14%,PCR-Southern blot进一步验证了转化植株基因组中含有该外源基因。各种影响转化效率因素的优化实验表明,当转化时菌液浓度的OD600为2.0、侵染时间为1 h、共培养时间为2 d、共培养温度为21℃及在共培养期间使用乙酰丁香酮等,均可明显提高转化频率。

转DREB1A基因地被菊耐旱节水性

选用已经获得的具有多重抗逆性的转DREB1A基因地被菊6个株系为试验材料,以未转基因的野生型植株‘WT’为对照,将各株系盆栽幼苗分别进行室温条件下和高温条件下的水分胁迫处理,通过研究水分胁迫前后各株系植株生理指标的变化规律,分析了各株系的耐失水特性,并利用方差分析及隶属函数综合评价的方法对不同株系的耐旱节水能力进行了评价。结果表明,在6个转基因地被菊株系中有5个株系的耐旱节水性优于‘WT’,且其中3个株系与‘WT’差异显著(p<0.05);有1个株系耐旱节水性不如‘WT’,但与‘WT’差异不显著。

干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究

以成熟胚诱导的愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料,将诱导型启动子rd29A驱动的拟南芥DREB1A基因导入粳型光温敏核不育系水稻4008S,共获得67株再生苗.再生苗经0.75mg/L除草剂草铵膦涂布筛选,有62株再生苗表现出对草铵膦抗性.PCR检测抗性苗中DREB1A基因,结果全为阳性.挑选部分进行Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中.在干旱胁迫下,转基因水稻当代(T1代)植株的电导率显著低于非转基因对照植株(P<0.05),脯氨酸含量显著高于对照植株(P<0.05),证明DREB1A基因能提高水稻对干旱胁迫的耐受性.

转DREB1A基因地被菊花Fall Color后代综合性状及耐寒性检测

以转35S和rd29A启动子驱动的AtDREB1A基因地被菊花植株为试材,以组织培养微扦插的方式进行繁殖,对获得的转基因各株系无性后代进行性状观察及自然低温条件下的抗性检测。结果表明,转基因株系以茎段为外植体进行组织培养扩繁,植株在大田中移栽成活率高且能够正常生长,与野生型相比,转基因植株株高、冠幅、分枝角度性状存在表型差异,而花期、花色不存在表型差异;转基因各株系在低温胁迫下相对电导率和膜伤害率均明显降低,表明转基因株系增强了对低温的胁迫耐性;2007年冬季转基因株系存活率高,露地越冬能力也明显增强。

NaCl、PEG双重胁迫下转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期抗性研究

对转DREB1A基因多年生黑麦草(Lolium perenne)T1代种子和多年生黑麦草非转化植株F1代种子分别用1.5%NaCl溶液、15%PEG溶液、1.5%NaCl+15%PEG进行处理。测定了相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、胚根长、细胞膜透性、相对含水量、叶绿素含量、萎蔫幼苗数、存活率等指标,研究了供试材料对单独胁迫和双重胁迫的抗性,并进行对比。相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、细胞膜透性、叶绿素含量等指标的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>PEG>NaCl+PEG。叶片相对含水量、存活率等指标的测定结果表明DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为PEG>NaCl>NaCl+PEG。萎蔫幼苗株数的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>NaCl+PEG>PEG。胚根长在三种胁迫下的响应差异不显著。DREB1A对NaCl、PEG单独胁迫和NaCl+PEG双重胁迫均具有一定程度抗性,比非转化植株的抗性明显增强。转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为干旱、盐碱地区改良和利用的植物资源。

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。

甜菊耐寒相关基因SrDREB1As的克隆与转录因子特性分析

AP2/ERF转录因子家族中DREB亚族的A-1亚组基因对植物耐寒性具有显著的调控作用。本研究通过同源克隆的方法在甜菊中获得2个A-1亚组基因,分别命名为SrDREB1A1和SrDREB1A2(NCBI基因登录号分别为MK163640和MK163641)。SrDREB1A1 ORF全长660 bp,编码219个氨基酸残基,预测的蛋白分子量为24.58 kDa,等电点为5.42。SrDREB1A2 ORF全长630 bp,编码209个氨基酸残基,预测的蛋白分子量和等电点分别为23.21 kDa和5.41。进化树分析发现,SrDREB1A1和SrDREB1A2分别与紫茎泽兰的AaCBF及菊花的DgDREB1A亲缘关系最近,序列分析发现二者都具有一个典型的AP2结构域。进一步对蛋白功能研究发现,SrDREB1A1和SrDREB1A2都定位在细胞核并且具有转录激活活性。本研究将通过转基因手段为提高甜菊的耐寒性提供重要的基因资源。

基因枪转化法获得草地早熟禾(Poa pratensis L.)转基因植株

将与植物抗旱耐盐有关的BADH-CMO双基因、CMO单基因、DREB1A单基因三种外源基因利用基因枪法分别轰击草地早熟禾的胚性愈伤组织,在附加100mg/L潮霉素的继代培养基筛选和附加50mg/L潮霉素的再生培养基中壮苗1个月,将抗性植株移栽到花盆中。经过PCR检测、Southern杂交分析,证明BADH-CMO双基因、CMO基因、DREB1A基因已经成功整合到草地早熟禾的植物基因组中。

以基因枪法转化日本结缕草获得转基因植株

将含有DREB1A和gus基因的双基因载体质粒包裹在金粉上,以基因枪轰击日本结缕草胚性愈伤组织,以gus基因的瞬时表达研究日本结缕草基因枪转化参数.结果表明,在1 100 psi压力下6 cm的轰击距离、每皿轰击2次的转化效果最好,而金粉和质粒用量对转化效率影响不显著;经过筛选和再生培养,检测到gus基因的稳定表达,并获得日本结缕草潮霉素抗性株系,PCR-Southern杂交证实外源DREB1A基因已整合到日本结缕草基因组中.

‘神马’菊花DREB1A基因的分离及同源遗传转化

逆境诱导转录因子DREB1A基因在植物中的超量表达能够提高植株对低温、干旱、盐渍、高温等非生物胁迫的耐性。从菊花中克隆得到DgDREB1A基因,构建了转基因表达载体pBIG-DREB1A,并转入农杆菌LBA4404中;在建立了菊花高效再生体系的基础上,优化受体再生体系,通过根癌农杆菌介导将DgDREB1A基因转入切花菊‘神马’品种。PCR结果显示,在获得的38株卡那霉素抗性植株中有8株为阳性,表明外源基因已整合到转化植株基因组中,转化效率为3‰。本研究为培育综合抗逆性良好的菊花新品种奠定工作基础。