推拿对腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X_3受体影响的实验研究

目的:观察推拿对腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X_3受体的影响,探讨推拿对腰椎间盘突出症镇痛效应的外周机制。方法:32只SD大鼠随机分为空白组、模型组、假手术组、推拿组。空白组不做任何处理,模型组和推拿组均将"L"形不锈钢柱插入椎间孔对DRG造成恒定压迫,假手术组除不将"L"形不锈钢柱插入椎间孔外,其余造模步骤同模型组。推拿组在造模后第4天开始推拿手法治疗,其余组均不做治疗。疗程结束后,检测大鼠机械反应阈值(PWT)、缩爪反应潜伏期(PWL),采用Western Blot方法观察DRG神经元P2X_3受体含量的变化。结果:空白组、假手术组大鼠在造模后PWT、PWL均没有显著性差异(P>0.05),模型组大鼠造模后PWT、PWL均显著降低(P<0.001),推拿治疗后与模型组相比较具有显著性差异(P<0.05)。与空白组、假手术组相比,模型组大鼠DRG神经元P2X_3受体含量明显升高(P<0.001),推拿治疗后P2X_3受体含量较模型组降低(P<0.05)。结论:推拿对腰椎间盘突出症大鼠有镇痛作用;推拿能够降低腰椎间盘突出症大鼠DRG神经元P2X_3受体的水平进而发挥镇痛效应。

一种原代培养大鼠DRG神经元的新方法

目的建立并提供一种可供客观衡量和评价实验研究结果的稳定、高效的体外原代神经细胞的培养模型。方法采用神经细胞专用无血清培养基——Neurobasal作为培养介质,用喜树碱纯化DRG神经元培养体系,通过对背根神经节分离、细胞培养以及纯化等多个环节和步骤的比较研究,确定了DRG神经元原代培养和纯化的最佳条件和步骤。结果采用上述方法,可获得具有良好活性的高纯度原代DRG神经元(>98%)。结论该培养体系稳定可靠、适用于生物学和药理学等相关的体外实验研究。

甲硫-脑啡肽对大鼠DRG分离神经元ATP-激活内向电流的抑制

本研究探讨了甲硫－脑啡肽（ｍｅｔ－Ｅｎｋ）对ＡＴＰ－激活电流（ＩＡＴＰ）的调制作用。实验在大鼠新鲜分离背根神经节（ＤＲＧ）神经元上进行。应用全细胞膜片钳技术所记录的ＩＡＴＰ为内向电流。在被检测的ＤＲＧ神经元中，９０．０％（４５／５０）的细胞对ＡＴＰ有反应。在４５个对ＡＴＰ感的细胞中：对大部分细胞（２９／４５）施加ｍｅｔ－Ｅｎｋ（１０－９～１０－５ ｍｏｌ／Ｌ）也引起一内向电流；少部分细胞（９／４５）为外向电流；其余的细胞（７／４５）未引起可检测的腹反应。预加ｍｅｔ－Ｅｎｋ后ＩＡＴＰ明显地被抑制，此种抑制作用为剂量依赖性的。在预加１０－９、１０－８、１０－７、１０－６、１０－５ ｍｏｌ／Ｌ ｍｅｔ－Ｅｎｋ后，ＩＡＴＰ的抑制分别为：１３．２±５．４％（ｎ＝５）、３９．２±８．６％（ｎ＝８）、５４．１±８．６％（ｎ＝ ８）、４３．３±７．９％（ｎ＝７）；４３．１±７．９％（ｎ＝７）（ｍｅａｎ±ＳＥＭ）。阿片肽拮抗剂纳洛酮能翻转此种抑制效应。ＩＡＴＰ的量－效关系表明，预加ｍｅｔ－Ｅｎｋ后曲线明显压低，在浓度为１０－３ｍｏｌ／Ｌ时ＩＡＴＰ下降约２５％，而Ｋｄ值几乎不变。

大鼠慢性背根节压迫诱致DRG大神经元兴奋性增强和Ih电流显著上调

目的:探讨大鼠CCD模型模拟的腰背痛诱致的DRG大神经元兴奋性改变及其离子通道机制。方法:建立大鼠慢性压迫腰膨大L4/L5 DRG的CCD模型,模拟临床常见的腰背痛的触诱发痛表现。制备整节L4/L5 DRG标本,应用全细胞膜片钳技术记录去极化电流刺激诱致的DRG大型神经元的兴奋性改变及其离子通道机制。结果:对直径>50μm的健康的DRG大神经元进行全细胞膜片钳记录。结果显示:给予去极化方波电流刺激可以诱致CCD模型大鼠DRG大神经元呈现兴奋性增强的表现,具体表现为相同刺激强度的电流注射在CCD模型DRG大神经元上诱致的动作电位的频率显著高于对照组神经元。同样的细胞放电增强也见于给予细胞斜波电流刺激。进一步的机制研究分析显示CCD模型大鼠上DRG大神经元的I_h电流明显高于对照组大鼠。结论:CCD模型可以诱致DRG大神经元呈现超兴奋状态,该兴奋性增强的状态主要由I_h电流增强来介导,为认识神经损伤诱致的病理性痛觉敏化尤其是触诱发痛的神经机制提供了实验证据。

微小RNAs在外周神经损伤修复中作用的研究进展

微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNAs,在神经发育、再生和疾病中起着至关重要的作用。周围神经损伤后,许多miRNAs会发生差异表达,这些差异表达的miRNAs通过负向调控下游靶基因的表达,参与受损神经的修复与再生。本文就miRNAs在周围神经再生中的调控作用进行综述,为周围神经损伤后的治疗提供潜在的策略。

巴氯芬对大鼠新鲜分离DRG细胞异四氢烟酸及蝇蕈醇激活电流的抑制作用

应用全细胞膜片钳技术，研究巴氯芬（baclofen）对新鲜分离的大鼠DRG神经元的作用。结果发现：GABAB受体选择性激动剂baclofen（10－5和10－4mol／L）对蝇蕈醇（muscimol）（10－5mol／L）和异四氢烟酸（isoguvacine）（5×10－5mol／L）-激活电流有抑制作用，并呈浓度依赖性。并对baclofen抑制GABAA选择性受体激动剂muscimol-和isoguvacine-激活电流反应可能的胞内转导机制进行了讨论。

福尔马林致痛上调大鼠DRG神经元SP与NMDA受体的表达

目的:观察DRG神经元膜SP受体与NMDA受体的表达,探讨二者在疼痛中的作用。方法:16只健康SD大鼠随机分为生理盐水(NS)组及福尔马林致痛(F)组,应用免疫荧光双标技术观察并比较两组大鼠DRG神经元膜SP受体与NMDA受体的表达的差异。结果:免疫荧光显示两组大鼠DRG神经元膜均有SP受体与NMDA受体共存。F组大鼠DRG神经元膜SP(NK1)的表达高于NS组,OD值分别为99.37±19.69(n=8)、60.10±21.65(n=8),P<0.05;F组大鼠DRG神经元膜NMDA(NR1)阳性产物的表达高于NS组,OD值分别为89.17±30.05(n=8)、56.31±13.75(n=8),P<0.05。结论:大鼠DRG神经元膜SP受体与NMDA受体有共存,福尔马林致痛大鼠DRG神经元SP受体与NMDA受体表达上调。

SO_2衍生物对大鼠神经元和心肌细胞几种离子通道的影响

为了阐明大气污染物SO2对神经系统和心血管系统的毒作用机制,采用全细胞膜片钳技术研究了SO2衍生物(NaHSO3和Na2SO3,分子比为1∶3)对大鼠海马、背根节神经元和心肌细胞膜上钠、钾、钙离子通道的影响.结果显示:(1)SO2衍生物可显著增大大鼠海马CA1区神经元钠电流,不影响钠通道的激活过程,但可使钠电流的失活曲线向去极化方向移动,延迟钠通道的失活过程;另外,SO2衍生物可显著增大瞬间外向钾电流(IA)和延迟整流钾电流(IK),不影响IA的激活过程,使IK的激活过程向负电压方向移动,促进IK的激活过程,而使IA的失活曲线向正电压方向移动,延迟IA的失活过程.(2)SO2衍生物显著增大大鼠背根节神经元钠电流(TTX-S钠电流和TTX-R钠电流),可使两种钠电流的激活和失活曲线均向去极化方向移动,但对失活的影响大于对激活的影响,即延迟钠通道的失活过程;SO2衍生物显著增大背根节神经元瞬间外向钾电流(TOCs)和延迟整流钾电流(IK),不影响TOCs的激活过程,但可使IK的激活曲线向超极化方向移动,促进IK的激活.另外,还可使TOCs的失活曲线向去极化方向移动,即延迟TOCs的失活.(3)SO2衍生物可显著增大大鼠心肌细胞L-型钙电流(ICa,L),使ICa,L的激活和失活曲线均向去极化方向移动,但对失活的影响大于对激活的影响;SO2衍生物显著增大心肌细胞钠电流,不影响钠通道的激活过程,但可使钠电流的失活曲线向去极化方向移动,延迟钠通道的失活过程;SO2衍生物显著增大心肌细胞瞬间外向钾电流(Ito),使Ito的激活曲线向超极化方向移动,促进Ito的激活过程,但可使Ito的失活曲线向去极化方向移动,延迟Ito的失活过程;此外,SO2衍生物还可显著增大心肌细胞内向整流钾电流(IK1),但不影响其反转电位.结果表明,SO2衍生物可能通过影响神经元和心肌细胞膜上离子通道的活动而对中枢神经、传导神经以及心血管系统产生不利影响.提示大气SO2污染可能与神经系统和心血管系统疾病的发生有关.

血竭对大鼠背根神经节细胞钠通道电流的影响

目的 :研究血竭对大鼠背根神经节细胞电压门控性钠通道电流的影响 .方法 :采用全细胞膜片钳记录法 ,在新鲜分离的大鼠背根神经节细胞上观察血竭对钠通道电流幅值的影响 .结果 :血竭剂量依赖地抑制单个 DRG细胞电压门控性钠通道电流 ,高剂量的血竭抑制作用不可逆 .结论 :血竭对背根神经节细胞钠通道电流的这种抑制作用 。

大鼠背根神经节同一分离神经元膜受体电生理学及细胞神经递质免疫组织化学检测方法

在新鲜分离的大鼠背根神经节（ＤＲＧ）神经元应用全细胞膜片钳技术记录并证实了膜受体的存在，然后将此同一细胞吸入一较大口径的微吸管，再转移至载玻片上，在倒置显微镜下完成细胞的固定、漂洗及免疚组织化学抗原－抗体反应和显色等步骤。应用这一方法成功地在单个ＤＲＧ神经元膜上确证了Ｎ－甲基－Ｄ－天冬氨酸及Ｐ物质自身受体的存在。

腺病毒介导的LacZ基因靶向性导入脊髓及示踪周围神经的动态过程

目的 由损伤的周围神经靶向性导入腺病毒介导的 L ac Z基因 (Ad L ac Z)至脊髓 ,动态观察病毒载体逆行输送到脊髓前角运动神经元、脊髓后根神经节 (dorsal root ganglia,DRGs)感觉神经元及基因产物顺行标记周围神经的全过程和特点。 方法 分别将 Ad L ac Z转染大鼠正中神经和胫神经近断端 ,然后以 10 - 0无创线吻合神经。在转染后 9周内的 2 4个不同时间点取出正中神经组的 C5～ T1 脊髓节段、DRGs连同臂丛 ,胫神经组的 L2 ～ L6 脊髓节段、DRGs连同骶丛。将脊髓和 DRGs的 5 0 μm横切片行 X- gal染色和免疫组织化学染色 ,臂丛和骶丛的整个标本分别行 X- gal染色。计数阳性脊髓前角运动神经元、DRGs神经元及周围神经轴突数 ,研究转基因表达在脊髓前角运动神经元、DRGs神经元及正中神经、胫神经的最早时间、高峰时间和持续时间。 结果 L ac Z基因能特异性、高效表达在损伤周围神经的感觉和运动神经元。转基因在脊髓和周围神经的表达严格限于感染神经的同侧。正中神经组标本各部位的转基因表达均早于胫神经组。胫神经组被标记的运动神经元和感觉神经元数均高于正中神经组。表达持续的时间在运动神经元最短 ,然后是感觉神经元 ,在周围神经持续时间最长。在同一组内 ,转基因表达在 DRGs神经元最早 。

CCK－8可对抗μ－阿片受体介导的对大鼠背根节神经元钙通道的抑制效应

ＣＣＫ－８在脊髓水平可对抗μ－阿片受体介导的抗伤害性作用，但其作用位，点及机制尚不清楚。本实验以急性分离的大鼠背根节（ＤＲＧ）神经元为标本，用全细胞膜片钳（ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐ）方法记录钙通道电流，观察分析特异性μ－受体激动剂羟甲芬太尼（ＯＭＦ）对电压依赖性钙通道电流的作用，以及在同一细胞上ＣＣＫ－８对此作用的影响。结果显示ＯＭＦ可明显抑制钙通道电流，其抑制作用可被μ－受体拮抗剂纳络酮或ＣＣＫ－８所翻转，而ＣＣＫ－８的作用又可被ＣＣＫ－Ｂ受体拮抗剂Ｌ３６５，２６０所对抗。结果提示：ＣＣＫ－８可在同一细胞上经ＣＣＫ－Ｂ受体对抗阿片效应。ＣＣＫ－８本身对钙通道电流并无增强效应，相反它可引起抑制作用。关于ＣＣＫ－８如何对抗μ－受体介导的机制有待进一步研究。

二次分层离心纯化成年大鼠背根节神经元的方法

目的:建立一种长时程的有效获得高度纯化成年大鼠背根节(dorsal root ganglions,DRG)神经元的方法。方法:将SD大鼠的DRG剥膜、消化制成单细胞悬液,牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)分层离心去除大部分非神经元细胞后接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上;培养1 d后,胰酶消化再次制成细胞悬液,BSA二次分层离心,再次接种于多聚赖氨酸处理的盖玻片上。BSA二次分层离心后的神经元为实验一(T1组)、单次离心的神经元为实验组二(T2组)、未经离心处理的神经元为对照组(C组)。各组除离心次数外,其余各方法相同。相差显微镜下观察上述各组培养神经元,结合βtubulinⅢ免疫荧光组化染色及MTT分析检测神经元纯化效果及细胞活力。结果:培养3 d后,T1组神经元比例达88.43±6.13%,较T2组、C组显著增高,差别具有统计学意义(P<0.05);MTT的结果显示与T2组、C组比较,T1组神经元的相对活力略微下降,但无统计学差异(P>0.05)。结论:二次纯化法是一种简单有效的成年大鼠DRG神经元纯化方法。

GDNF对缺气损伤的体外培养新生大鼠背根节神经元的作用

运用体外缺气损伤的细胞模型 ,研究GDNF对损伤的新生大鼠背根节神经元( DRG)是否有保护作用。采用原代培养的方法 ,用 N1无血清培养基分离培养 DRG神经元 2 4h后 ,加入含 2 0 μg/m L GDNF的无血清培养液 ,然后液体石蜡封闭培养液 ,继续培养 4,8,1 2 ,2 4h,分别做 MTT实验检测细胞活性 OD值 ,台盼蓝染色记数 ,细胞总蛋白测定以及形态学观察突起生长状况。结果表明 :1封闭 1 2 h后 ,GDNF组的 DRG细胞存活数同对照组相比有显著升高 ( * * P <0 .0 1 ) ,其余各时间点均无显著性差异。缺气损伤 8h和 1 2 h后 ,GDNF组的 DRG细胞总蛋白较对照组显著升高 ( * * P <0 .0 1 ,* P <0 .0 5) ,其余各时间点均无显著性差异 ;2各时间点 DRG细胞活性及突起长度的变化差异均不显著。缺气损伤一定时间后 ,GDNF对新生大鼠 DRG细胞的存活数及细胞总蛋白有明显的保护作用 ,而对细胞活性及突起的生长则没有明显的促进作用。

2,5-己二酮对大鼠运动及感觉神经元神经生长因子表达的影响

目的 研究正己烷的代谢产物2 ,5 己二酮对大鼠神经系统运动、感觉神经元内源性神经生长因子(NGF)表达的影响。方法 采用原代培养的大鼠背根神经节(DRG)感觉神经元和培养的大鼠脊髓前角运动神经元瘤细胞系VSC4 - 1细胞,用相差显微镜观察细胞形态,同时用免疫组化方法分析不同浓度2 ,5 HD(2 . 5、5 . 0、10 . 0、2 0 . 0mol L)染毒2 4小时后DRG、VSC4 1细胞内NGF含量的变化。结果 与对照组相比,2 ,5 己二酮染毒剂量为5 . 0、10 . 0、2 0 . 0mmol L时,皆可使DRG细胞及VSC4 1细胞NGF表达量显著下降(P <0 . 0 5 ) ;各剂量组间两两比较发现随着染毒剂量增高,两类细胞NGF表达水平的下降有愈为明显的趋势。结论 2 ,5 己二酮可降低大鼠DRG感觉神经元和脊髓前角运动神经元(VSC4 . 1细胞)、内源性NGF的表达水平,并进一步抑制了两类细胞的生长与存活。

皮质酮对大鼠背根神经节细胞钙电流的快速抑制作用

探讨了皮质酮 (Corticosterone)对急性分离的大鼠背根神经节细胞 (DRG神经元 )上电压依赖性钙通道电流的快速作用及作用机制。实验采用全细胞膜片钳方法 ,结果显示三种浓度的皮质酮 ,10 7mol/L ,10 9mol/L ,10 12 mol/L均可以在 3～ 5s的时间内 ,快速抑制DRG神经元上的电压敏感钙通道电流 ,其平均抑制的程度分别为4 8% ,37%和 2 5 %。且这种快速抑制作用在吹药 15s后可以达到最大 ,停药 2 0s后钙电流基本恢复为原来的大小。在外液中加入 5 0 0nmol/L的PKC抑制剂BIS之后 ,皮质酮的对钙电流的快速抑制作用被阻断 ,提示这一作用可能与PKC信号转导途径有关。

大鼠背根神经节神经元H^+-门控电流及其特征

目的:探讨大鼠背根神经节(DRG)神经元H+-门控电流(也称ASICs电流)及其特征;比较在SD大鼠DRG和三叉神经节(TG)神经元电流分布的异同。方法:在急性分离的大鼠DRG神经元上,采用全细胞膜片钳技术记录电流。结果:依据在pH5.0条件下记录的ASICs电流动力学特征,将急性分离的DRG神经元上的ASICs电流分为四类:T-型、S-型、B-型和O-型;并推断此四种电流类型在周围感觉神经元上分布的一般规律。结论:在SD大鼠DRG和TG神经元ASICs电流都是以"S"型电流为主。4种电流的激活动力学τon(0～63%上升时间)和细胞直径无明显相关性。

SiRNA抑制大鼠背根神经节神经元电压依赖型钠通道Nav1.8表达的实验研究

目的应用小片段干扰RNA(SiRNA)转染原代培养背根神经节(DRG)神经元,观察SiRNA干扰DRG神经元基因Nav1.8表达的有效性。方法根据RNA干扰的原理及SiRNA的设计原则,设计2个长度为21bp的以Nav1.8基因为靶点的SiRNA(SiRNAa和SiRNAb),另选择相同长度的无义双链RNA作为阴性对照RNA。T7RNA聚合酶的作用下体外转录合成SiRNA,阳离子脂质体转染试剂将SiRNA导入体外培养DRG神经元,于转染后48h提取RNA,采用RT-PCR和荧光定量PCR检测Nav1.8基因的表达情况。结果在靶向Nav1.8的两个SiRNA序列中,SiRNAa转染神经元后导致Nav1.8基因表达显著降低(48.32±6.84)%,SiRNAb使Nav1.8表达降低(23.32±3.19)%,P均<0.01,阴性对照SiRNA对Nav1.8的表达不产生影响。结论利用体外转录合成的SiRNA成功转染原代培养的DRG神经元,并诱导产生内源性Nav1.8基因的特异性表达抑制。具有较高干扰效应的SiRNA片段可应用于抑制Nav1.8基因表达,进而研究Nav1.8的功能及在疼痛治疗中的作用。

神经元阵发放电序列的非稳定周期轨道分析

大鼠背根节 (dorsal root ganglion,DRG)神经元在慢性压迫损伤后可自发产生大量不规则的阵发放电。为探讨此类放电序列的动力学机制 ,我们以单纤维引导的方法记录了受损神经元阵发放电的动作电位间期 (interspike interval,ISI)序列 ,并计算得到放电的事件间期 (interevent interval,IEI)序列。然后 ,运用一种从时间序列中识别非稳定周期轨道 (unstable periodic orbits,UPOs)的新方法对阵发放电 IEI序列进行分析。从得到的 1 0例数据中无一例外地检测到了具有高度统计显著性的非稳定周期 1轨道。在此基础上 ,进一步对阵发放电的非稳定周期轨道分级进行了初步研究 ,检测到了显著的周期 2与周期 3轨道。结果表明 :受损 DRG神经元的不规则阵发放电节律具有显著地确定性动力学机制。

电压门控钠通道与背根神经元伤害性传入

背根神经节 (DRG)神经元伤害性传入涉及到多层面复杂的神经递质与其相关靶受体的分子参与和调控。本文侧重结合DRG神经元中钠电流的表达分布规律 ,简要地论及了电压门控钠通道与DRG神经元伤害性感觉传入及其调制的一些关系。