Drosha基因在人卵巢癌顺铂耐药细胞中的表达研究

目的探讨Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药的关系。方法分别采用实时定量PCR和免疫印迹法检测Drosha基因mRNA及其蛋白在A2780/DDP及A2780细胞中表达的差异。结果 A2780/DDP细胞中Drosha基因mRNA及其蛋白的表达量分别是A2780细胞表达量的(56.79±1.65)%和(50.16±1.34)%,两者比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论 Drosha基因在A2780/DDP细胞中明显下调,提示Drosha基因和卵巢癌顺铂耐药相关。

实时定量RT-PCR检测乳腺癌组织Drosha基因表达及其意义

目的通过检测Drosha在乳腺癌组织中的表达情况,探讨其在乳腺癌发生发展中的意义。方法乳腺癌肿瘤组织与正常乳腺组织标本各78例自身配对分成肿瘤组与正常组,提取总RNA,利用SYBR Green1实时定量RT-PCR方法检测Drosha基因mRNA的表达情况。结果在mRNA水平上,Drosha基因在71.80%(56/78)的癌组织中下调,28.20%(22/78)上调。经REST软件分析,其表达下调具有统计学意义(P<0.01),Drosha mRNA低表达与TNM分期差异有统计学意义(P<0.01),与患者年龄、月经状态、肿瘤大小、淋巴结是否转移、组织学分级、激素受体状态(ER、PR和HER-2)等差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 Drosha基因在乳腺癌中表达下调,可能与乳腺癌的发生发展有关。

人卵巢癌顺铂耐药细胞EZH2基因沉默对Drosha基因表达的影响

目的探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因对卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP的Drosha基因表达的影响。方法获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(shRNA)的人卵巢癌获得性耐药细胞株A2780/DDP-shEZH2,实时荧光定量PCR法和免疫印记法检测转染株的Drosha基因表达。结果以未转染组A2780/DDP细胞Drosha的表达水平为100.00%,EZH2-shRNA转染组A2780/DDP-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.33±9.24)%和(51.28±3.25)%。结论沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。

三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因克隆及其在性腺发育过程中的表达分析

本研究利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Drosha和Exportin 5基因的cDNA全长序列,Drosha基因长度为3443 bp,编码1038个氨基酸,预测蛋白质包含2个相邻的RNA酶Ⅲ结构域(RⅢDa和RⅢDb)和1个双链RNA结合结构域(dsRBD)。Exportin 5基因全长为5000 bp,编码1208个氨基酸,预测蛋白质包含1个Importin-βN-末端结构域(IBN-N)和1个核输出蛋白结构域(XPO-1)。同源分析显示,三疣梭子蟹Drosha氨基酸序列与其他物种高度相似,与日本对虾(Marsupenaeus japonicus)相似度最高,达94%。qRT-PCR分析结果显示,Drosha和Exportin 5基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,其在卵巢和肝胰腺中的表达量最高(P<0.05);在精巢不同发育时期,2个基因表达量的变化趋势一致,均在Ⅱ期(精母细胞增殖、分化期)表达量最高;在卵巢发育过程中,2个基因表达量的变化趋势也大致相同,随着卵巢发育(Ⅱ~Ⅴ期)逐渐升高。研究表明,Drosha和Exportin 5基因可能通过调控miRNA的合成来影响三疣梭子蟹性腺发育过程,为深入解析三疣梭子蟹性腺发育调控机制提供了重要参考。

小RNA与蛋白质的相互作用

小分子调控RNA,包括siRNA(small interfering RNA)、miRNA(microRNA)和piRNA(piwi interacting RNA)、hsRNA(heterochromatin associated small RNA)等,是当前生命科学研究的前沿热点。越来越多的证据表明,这些小分子R N A存在于几乎所有较高等的真核生物细胞中,对生物体具有非常重要的调控功能。它们通过各种序列特异性的RNA基因沉默作用,包括RNA干扰(RNAi)、翻译抑制、异染色质形成等,调控诸如生长发育、应激反应、沉默转座子等各种各样的细胞进程。随着对这些小分子调控RNA的发现,一些RNase III酶家族成员、Argonaute蛋白质家族成员及RNA结合蛋白质等先后被鉴定为小RNA的胞内蛋白质合作者,参与小RNA的加工成熟和在细胞内行使功能。本综述简介一些RNA沉默作用途径中重要组分的结构和功能的研究进展。

miRNA成熟关键基因DROSHA和DICER的多态性与无精症的相关性

目的探讨miRNA成熟关键基因DICER和DROSHA多态性与男性无精症的相关性。方法应用PCR-限制性片段长度多态性技术，检测330例原发性无精症和282名正常生育男性DICER基因rs3742330和DROSHA基因rs10719多态位点的基因型和等位基因频率。结果病例组中DICER基因rs3742330位点A等位基因频率显著高于对照组（72．0％vs．64．4％），差异有统计学意义（P=0．004），病例组DICER基因rs3742330位点AA基因型频率高于对照组（53．0％vs．41．8％，95％CI：1．071-3．124），差异有统计学意义（P=0．027），而DROSHA基因rs10719位点等位基因频率及基因型频率在两组间的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论DICER基因rs3742330位点多态性与无精症有关联，rs3742330AA基因型可能与无精症的发生存在关联。

miRNA成熟相关基因DICER、DROSHA、RAN基因多态性与不明原因复发流产的相关性研究

目的探讨miRNA成熟关键基因DICER、DROSHA和RAN的基因多态性与女性复发流产的相关性。方法收集2013年6月至2015年12月于四川大学华西第二医院就诊的不明原因复发流产(URSA)患者共217例,至少有1次生育史的育龄妇女为正常对照组390例,对照组为同期进行体检和孕前检查育龄妇女。采用病例对照研究的方法,应用PCR-限制性片段长度多态性技术检测miRNA成熟过程中关键基因DICER rs3742330、DROSHArs10719和RAN rs14035单核苷酸多态性。结果 DICERrs3742330,DROSHArs10719和RANrs14035各等位基因和基因型频率在URSA组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。联合分析发现,DICERrs3742330/DROSHArs10719GG/TT+TC协同会增加复发流产的风险(OR=1.657,95%CI=1.006~2.731,P=0.047)。虽然DICERrs3742330/RANrs14035GG/TT+TC在URSA组较对照组增高,但差异无统计学意义(OR=1.977,95%CI=0.956~4.087,P=0.066),而DROSHA10719/RAN14035TT+TC/TT+TC与复发流产无相关性(OR=0.958,95%CI=0.679~1.353,P=0.808)。结论DICERrs3742330联合DROSHA rs10719可能与URSA相关。

雌激素孕激素联合紫杉醇对人卵巢癌细胞生长调控及Drosha表达的影响

目的探讨雌激素、孕激素和紫杉醇对人卵巢癌细胞生长调控及Drosha表达的影响。方法雌激素、孕激素和紫杉醇体外作用人卵巢癌细胞，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期，实时荧光定量PCR和Westernblot法检测DroshamRNA和蛋白的表达。结果对照组、雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的细胞生长抑制率分别为0％、（31．53±8．21）％、（25．22±15．50）％、（46．71±4．25）％、（69．46±3．71）％和（47．35±39．02）％，雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的细胞生长抑制率与对照组比较，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。相对于ER（-）的卵巢癌细胞，雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的DroshamRNA表达水平分别为1．62±0．10、1．60±0．10、1．75±0．16、1．95±0．20和1．53±0．06，与对照组（1．00）差异均有统计学意义（均P〈0．05）；相对于ER（＋）的卵巢癌细胞，雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的DroshamRNA表达水平分别为1．03±0．14、1．60±0．09、1．75±0．16、1．60±0．10和1．53±0．06，孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的DroshamRNA表达水平与对照组差异均有统计学意义（均P〈0．05）。相对于ER（-）的卵巢癌细胞，对照组、雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的Drosha蛋白表达水平分别为0．25±0．05、0．87±0．30、0．85±0．38、1．30±0．21、1．75±0．83和1．62±0．82，雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的Drosha蛋白表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；相对于ER（＋）的卵巢癌细胞，对照组、雌激素组、孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的Drosha蛋白表达水平分别为0．25±0．05、0．28±0．16、0．85±0．38、1．30±0．21、0．94±0．18和1．62±0．82，孕激素组、紫杉醇组、雌激素联合紫杉醇组和孕激素联合紫杉醇组的Drosha蛋白表达水平与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论雌激素、孕激素联合紫杉醇能够抑制人卵巢癌细胞的生长，且雌激素、孕激素和紫杉醇均能改变细胞的凋亡率，雌激素和紫杉醇能够改变细胞周期。雌激素、孕激素联合紫杉醇通过上调Drosha的表达，起到抑癌或增敏作用，且与雌激素受体的表达相关。

靶向EZH2基因的shRNA干扰对人卵巢癌细胞Drosha基因表达的影响

目的:探讨RNA干扰沉默果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对卵巢癌细胞株A2780的Drosha基因表达的影响。方法:获得稳定表达EZH2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的人卵巢癌细胞株A2780-shEZH2,实时定量PCR法(qRT-PCR)和免疫印记法(Western blot)检测转染株的Drosha基因表达。结果:以未转染组A2780细胞Drosha的表达水平为100%,EZH2-shRNA转染组A2780-shEZH2细胞Drosha的mRNA及蛋白水平分别上升(53.02±4.32)%和(51.26±1.35)%,与未转染组比较差异有统计学意义(P<0.001)。结论:沉默EZH2基因可以上调Drosha基因的表达。

Drosha通过调控微RNA-195-5P促进胃癌细胞的迁移和侵袭

目的 :探讨Drosha对胃癌MGC-803和SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响及其可能的作用机制。方法:将携带有Drosha-shRNA的重组慢病毒感染胃癌MGC-803和SGC-7901细胞,以感染携带有阴性对照(negative control,NC)-shRNA的重组慢病毒作为对照。采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测转入Drosha-shRNA后对MGC-803和SGC-7901细胞中Drosha mRNA和蛋白表达的影响,Transwell小室迁移和侵袭实验分别检测Drosha下调对MGC-803和SGC-7901细胞迁移和侵袭能力的影响;实时荧光定量PCR检测Drosha下调的MGC-803和SGC-7901细胞中微RNA-195-5P(microRNA-195-5P,miR-195-5P)的表达水平。在Drosha下调的胃癌细胞中采用脂质体法同时转入miR-195-5P-inhibitor,实时荧光定量PCR检测miR-195-5P的下调效果,Transwell小室迁移和侵袭实验分别检测下调miR-195-5P表达对细胞迁移和侵袭能力的影响。采用脂质体法将miR-195-5P-mimics转染MGC-803和SGC-7901细胞,实时荧光定量PCR检测miR-195-5P过表达的效果,Transwell小室迁移和侵袭实验分别检测miR-195-5P过表达对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 :感染Drosha-shRNA重组慢病毒后,MGC-803和SGC-7901细胞中Drosha mRNA和蛋白表达水平均较对照组明显下调(P值均<0.01),细胞的迁移和侵袭能力均明显被抑制(P值均<0.05),miR-195-5P的表达水平明显上调(P值均<0.001)。成功在Drosha下调的胃癌MGC-803和SGC-7901细胞中下调miR-195-5P的表达水平(P值均<0.05),miR-195-5P表达下调可以恢复Drosha下调对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响(P值均<0.05)。成功将miR-195-5P-mimics瞬时转入MGC-803和SGC-7901细胞,MGC-803和SGC-7901细胞中miRNA-195-5P的表达水平明显上调(P值均<0.01),细胞的迁移和侵袭能力均明显降低(P值均<0.01)。结论 :Drosha可促进胃癌细胞的迁移和侵袭能力。Drosha与miR-195-5P的表达呈负相关性,Drosha通过调控miR-195-5P的表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭。

DROSHA基因多态性及TORCH感染与育龄女性复发性自然流产的关联

目的探究DROSHA基因rs10719位点多态性及TORCH感染与育龄女性复发性自然流产(RSM)的关联。方法以2018年12月-2020年12月武汉市第四医院古田院区100例RSM孕龄女性为RSM组,并以同期正常早孕女性72名为对照组,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测DROSHA基因多态性,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TORCH感染及封闭抗体(BA),比较不同流产次数患者、经免疫治疗后BA转阳患者及BA阴性组的DROSHA基因多态性及TORCH感染率,分析其对经免疫治疗后BA转阳的预测价值。结果RSM组DROSHA基因rs10719位点TT/TC型检出率及TORCH感染率高于对照组,DROSHA基因rs10719位点多态性及TORCH感染是影响RSM发生的危险因素(P<0.05);TORCH感染组及未感染组DROSHA基因rs10719位点多态性对比,无统计学差异;不同流产次数患者的DROSHA基因多态性及TORCH感染率对比,无统计学差异;BA转阳及BA阴性组的DROSHA基因多态性对比,无统计学差异;BA转阳组的TORCH感染率低于BA阴性组(P<0.05);TORCH感染预测经免疫治疗后BA转阳的AUC为0.757。结论DROSHA基因rs10719位点多态性及TORCH感染是影响反复性自然流产发生的危险因素,但与复发流产次数无关,且TORCH感染对RSM患者经免疫治疗后BA转阳具有预测价值。