小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因敲除载体的构建

目的 :构建用于小鼠牙本质涎磷蛋白基因敲除的载体 ;方法 :PCR获得上、下游两条同源臂 ,将同源臂和正、负双向筛选标志按一定顺序克隆到载体 pBluescript中 ,序列测定确认正确后 ,NotI酶切使载体线性化 ;结果 :载体中各部分的排列顺序与预期一致 ;结论 :获得了小鼠牙本质涎磷蛋白基因敲除的载体 ,为以后的工作打下了基础。

遗传性牙本质发育不全Ⅱ型DSPP基因新突变

目的分析我国遗传性牙本质发育不全Ⅱ型(dentinogenesisimperfectatypeⅡ,DGI-Ⅱ)患者DSPP基因突变特征,从分子水平探讨DGI-Ⅱ的发病机制。方法抽提2个汉族遗传性牙本质发育不全Ⅱ型家系患者外周静脉血基因组DNA,应用聚合酶链反应及DNA测序技术,结合序列分析方法,对2个家系共13名家庭成员的DSPP基因1～4号外显子及其邻近序列进行突变分析。结果家系A中的患者在DSPP的第4外显子发生Asn164Tyr突变;家系B的患者在DSPP第4外显子发生Cys159Trp突变。结论这两个突变系是国内外尚未报道的新突变。

小鼠牙胚、软骨组织中牙本质涎磷蛋白基因的克隆

目的 :从小鼠牙胚、软骨组织中克隆牙本质涎磷蛋白基因 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)。方法 :采用RT -PCR方法 ,从小鼠牙胚及软骨组织中克隆DSPP基因片段 ,将所得片段装入载体pGEM -TEasyVector进行序列测定。结果 :从两种组织中均获得 719bp的特异性片段。序列分析表明 ,与已发表的DSPP序列99.7%同源。结论 :成功地从小鼠牙胚、软骨中克隆到DSPP基因部分序列。结果提示 :除牙齿组织外 ,DSPP还可在软骨中表达 。

Ⅱ型牙本质发育不全的致病基因研究进展

牙本质发育不全症是一种常染色体显性遗传病,其致病基因定位于4q2l.临床上分为三型:型(Dentinogenesis Imperfecta type,DGI-)主要见于成骨发育不全(OsteogenesisImperfecta,OI)患者的口腔,其病因被广泛认为是由型胶原基因突变导致.型(Dentinogenesis Imperfecta type,DGI-)是一种特殊的遗传性牙本质发育不全,在美国马里兰州的3个隔离民族群中独立发生.型(Dentinogenesis Imperfecta type,DGI-)在临床上最为常见,成为研究热点.型牙本质发育不全的致病基因主要为牙本质唾液酸焦磷酸蛋白基因(dentin sialophosphoprotein,DSPP)突变引起,独立发生且具有高度的遗传异质性.主要对牙本质发育不全型的候选基因及DSPP的突变进行了综述.

DSPP基因启动子不同片段启动活性的对比分析

目的:对比分析牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子不同片段的启动活性。方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察DSPP基因启动子不同片段的启动活性。结果:在MDPC-23细胞中,DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体均不同程度地表现了启动活性,其启动活性有差异(P<0.01)。结论:DSPP基因启动子不同片段的启动活性有差异,其活性变化反映位于-95bp～54bp、-410bp～-195bp、-1243bp～-791bp、-1447bp～-1243bp、-3519bp～-2475bp区存在潜在的增强子;-195bp～-95bp、-670bp～-410bp、-2475bp～-1447bp区存在潜在的抑制子。进一步明确了DSPP基因启动子的结构,为今后研究DSPP基因的特异性表达奠定基础。

遗传性乳光牙本质家系致病基因突变的鉴定

目的对一个遗传性乳光牙本质（dentinogenesis imperfecta shieldstype Ⅱ ，DGI-Ⅱ）家系进行DSPP基因的突变分析。方法采集家系成员外周血或胎儿绒毛组织，用酚氯仿法提取基因组DNA。应用聚合酶链反应（polymerasechain reaction，PCR）-Sanger测序方法鉴定先证者DSPP基因第2～5外显子及外显子／内含子衔接区序列，并进行突变分析；针对突变位点设计错配引物引入AluI酶切位点，通过限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳方法在该家系正常人及60名无关正常个体中进行致病突变验证；构建含微型DSPP基因的pcDNA3．1基因表达载体，在体外培养细胞中验证突变致病性。结果该家系3例患者和一名胎儿均携带DSPP基因内C．52—1G〉A的杂合突变，突变造成该基因第3外显子5’端剪接点变异；60名对照者和家系正常个体均未携带该突变；微小基因（Minigene）体外表达显示e．52—1G〉A导致DSPP基因转录产物第3外显子的跳跃剪接。结论本研究在一个DGI-Ⅱ家系中发现了DSPP基因内一个新的致病剪接突变（c．52—1G〉A），并在此基础上为先证者提供了产前基因诊断。

一个遗传性牙本质发育不全家系的分子遗传研究

目的研究一个常染色体显性牙本质发育不全家系发病的遗传基础。方法通过对一个DSPP家系临床检查和家族史调查，连锁分析和DSPP基因的突变检测，以及限制性片段长度多态分析方法，分析该家系发病的分子基础。结果连锁分析发现，该疾病致病基因与微卫星标记D4S1534完全连锁，对位于该区域的DSPP基因进行测序分析，发现一个新的致病突变（C．49C→T，p．Prol7Ser），该突变位于DSPP基因的第1外显子。该家系所有患者中都检测到了这一致病突变，但家系中的正常个体和100个无亲缘关系的正常人中未发现这个突变。结论p．Pr017Ser是牙本质发育不全Ⅱ型致病基因DSPP的一个新的致病突变。我们的研究进一步拓展了对牙本质发育不全疾病分子遗传基础的认识。

一个遗传性牙本质发育不全Ⅱ型家系的临床及遗传学分析

目的探讨一个遗传性牙本质发育不全(dentinogenesis imperfecta,DGI)Ⅱ型家系的临床表型和遗传学特点,明确其致病原因,并为遗传咨询提供依据。方法收集先证者及其家系成员的临床资料,采集外周血样,提取全基因组DNA,通过全外显子组测序检测潜在的致病变异位点。结果该家系患病成员表现为患牙呈琥珀色半透明状、球状牙冠、牙颈短缩、牙齿磨耗、髓腔及根管闭锁,与DGI-Ⅱ型相符,其牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因第5外显子均存在c.2837delA(p.Asp946Valfs*368)杂合移码变异,未见文献报道和数据库收录,根据美国医学遗传学与基因组学学会指南评级为疑似致病变异(PVS1_Strong+PM2)。结论DSPP基因第5外显子c.2837delA(p.Asp946Valfs*368)杂合移码变异可能是该家系的致病原因。上述发现丰富了DSPP基因的变异谱,为该家系的分子诊断和遗传咨询提供了依据。

人牙本质涎磷蛋白启动子驱动LacZ报告基因在人牙胚间充质细胞中表达

牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达是细胞向成牙本质细胞分化的标志。试图分析人DSPP启动子及构建人DSPP启动子驱动的Lac Z基因表达的报告体系,从而方便快捷检测细胞是否向成牙本质细胞分化。为了建立能表达DSPP的细胞体系,分离了人牙胚间充质细胞,并用地塞米松诱导培养液进行诱导,结果显示,该诱导培养液能有效地诱导人牙胚间充质细胞DSPP基因的表达。利用双荧光素酶报告系统对4段人DSPP基因5′上游区域(-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54和-1 027-+54)进行分析,结果显示-2 500-+54区域的启动子活性最高。5′上游区从?2 500 bp延长到?4 000 bp时,启动子活性下降;5′上游区从-2 500 bp缩短至-1 447 bp时,启动子活性下降;再次将-1 447 bp缩短至-1 027 bp时,启动子活性进一步下降。结果暗示在-4 000 bp至-2 500 bp区域存在转录抑制元件,-2 500 bp至-1 027 bp区域存在转录激活元件。用-2 500-+54启动子区域和Lac Z基因构建ph DSPP-Lac Z慢病毒报告载体,并分别在人牙胚间充质细胞和永生化人牙胚间充质细胞系ih EDMC4上检测ph DSPP-Lac Z报告载体的功能,通过X-Gal染色,结果显示在2种细胞牙向分化过程中均可检测到Lac Z基因的表达。研究构建的ph DSPP-Lac Z慢病毒报告载体可为诱导人源细胞牙向分化、牙齿发育、牙齿再生工程等研究中DSPP的表达检测提供一种更加便捷的手段。