薰衣草DXR基因在转基因烟草中的功能分析

揭示薰衣草DXR基因的生物学功能,将为薰衣草精油性状改良提供科学依据。基于此,以烟草为例,利用农杆菌介导法对烟草进行了DXR基因的遗传转化,获得了10株转DXR基因的烟草植株,通过荧光定量技术确定了其在不同转基因植株中的表达量,利用GC-MS技术测定了转基因植株叶片中萜类挥发物的含量情况,为解析薰衣草DXR基因在萜类化合物代谢中的作用提供了依据。

DxR Clinician教学在全科专业规培学员临床思维能力培养中的作用

于2022年1月31日至2023年2月28日,将同济大学附属同济医院的30名全科专业住院医师规范化培训学员以随机数字表法分为试验组和对照组,每组均为15人。试验组应用DxR Clinician(简称DxR)系统进行9次虚拟诊疗课程;对照组以CBL(基于病例的学习)病例讨论形式进行9次相应主题的讨论课。应用满意度调查表了解两组规培学员对各自授课方式的满意度情况,同时应用年度考核成绩评估教学效果。实践表明,应用DxR系统的教学形式有助于提高全科规培学员的临床思维能力和自主学习能力,值得在全科医师规范化培训中广泛推广。

DxR clinicians在三年级本科生问诊及临床思维训练方面的应用与探索

利用DxR clinicians软件对三年级本科生进行问诊及临床思维训练课程,学生普遍认为该课程有利于提高学生问诊思路及临床思维的培养,有利于临床岗位胜任力及医患沟通能力、职业道德培养,有利于提高学生分析问题、解决问题的能力。该软件应用可在其他年级教学、培训及考试中适当推广.

DXR+OSCE教学模式对提高本科护生临床综合能力的效果研究

目的:探讨采用DXR+OSCE教学模式对提高本科护生临床综合能力的效果研究。方法:采取整群抽样法抽取2017级与2018级的全体本科护生共840人。2017级作为对照组,采取传统教学模式;2018级作为试验组,采用DXR+OSCE教学模式;两级教学后进行相同的考核,比较考核结果;并对试验组教学前后发放调查问卷。结果:试验组考核成绩明显高于对照组(P<0.05);问卷调查结果显示该教学模式能提高护生的思维能力、护患沟通能力。结论:DXR+OSCE教学模式能有效地提高本科护生的临床综合能力。

枇杷DXR基因的克隆及其在果实成熟过程中的表达分析

【目的】为了解枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)1-脱氧木酮糖-5-磷酸(DXP)还原异构酶基因(DXR)的序列特点及其在果实成熟过程的表达特性,【方法】以不同类型枇杷品种‘早钟6号’(红肉)和‘白玉’(白肉)不同成熟阶段的果肉和果皮为试材,采用RT-PCR结合RACE法和qRT-PCR方法对DXR基因进行了克隆,并对其在枇杷果实成熟过程中的表达进行了分析,【结果】枇杷DXR基因的cDNA序列全长1 743 bp,编码473个氨基酸,蛋白质相对分子质量(Mw)为51 299.8 Da,等电点(pI)为6.52(GenBank登录号:JX089590)。qRT-PCR分析表明,在枇杷果实成熟过程中,DXR在不同类型枇杷的不同时期表达不尽相同:在果皮中,‘早钟6号’品种的DXR基因在果实成熟的各个阶段的表现为表达量较为稳定,而在‘白玉’品种中,DXR基因的表达存在较为明显的先增加后降低的过程,其表达量在褪绿期达到最高。而在果肉中,无论是‘早钟6号’还是‘白玉’品种,DXR基因的表达从果实成熟过程中的未转色期到黄熟期表现为持续下降;到成熟期时,‘早钟6号’品种的DXR基因存在明显的上调现象,而在‘白玉’品种中则无此明显变化,【结论】DXR基因对于枇杷类胡萝卜素的合成没有限制作用,至少作用不明显。

川芎嗪对人肝癌耐药细胞Bel-7402/DXR多柔比星蓄积的影响

目的考察中药川芎有效成分川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)对人肝癌耐药细胞Bel-7402/DXR中多柔比星(DXR)蓄积的影响。方法将人肝癌细胞耐药株Bel-7402/DXR及其亲本细胞Bel-7402分为6组:亲本空白对照组(Parental)、耐药空白对照组(Resistance)、亲本多柔比星组(Parental+DXR)、耐药多柔比星组(Resistance+DXR)、TMP组(Resistance+DXR+TMP)、维拉帕米(VRP)阳性对照组(Resistance+DXR+VRP),荧光显微镜下观察细胞内DXR荧光强度,流式细胞术检测细胞内DXR的平均荧光强度。结果荧光显微镜结果显示,(Resistance+DXR)组、TMP组、VRP组,其细胞内DXR荧光强度分别占Parental+DXR组的(50.03±6.01)%、(119.34±5.4)%、(169.25±21.0)%;流式细胞术结果显示:Resistance+DXR组、TMP组、VRP组细胞内DXR平均荧光强度分别为Parental+DXR组的(82.08±6.98)%、(134.43±39.5)%、(262.74±47.18)%。结论TMP可使人肝癌耐药细胞Bel-7402/DXR中抗癌药多柔比星的蓄积增加,其机制可能与逆转P-gp对药物的外排功能有关。

HGF介导DXR诱导肝癌细胞的凋亡作用

为了解肝细胞生长因子（HGF）对DXR诱导凋亡效用。方法：肝癌细胞处理分为单用组：DXR、ActinD和HGF。联合组DXR（0．0lug／ml）＋HGF（l0，20，30ng／ml）、DXR＋ActinD＋HGF；生理盐水及牛血清白蛋白对照组。测定MTT值，H-E染色及Hoe－chest33258荧光染色观察细胞形态。结果：24h大剂量DXR引起10％癌细胞凋亡、54％细胞死亡，小剂量者无明显诱导凋亡作用；大剂量ActinD凋亡细胞＜30％。HGF10－50ng／ml无明显诱导凋亡效用。DXR（0．0lug／ml）＋HGF(10，20，30ng/ml）组48h后随HGF剂量加大细胞凋亡数亦增加。依次加入DXR、放线菌素D后对HGF介导的效用有抑制性。结论：合用DXR和HGF能够诱导肝癌细胞凋亡，可能与HGF介导的信号传导有关。

农杆菌介导银杏遗传转化体系的建立及Gb-DXR基因表达载体的构建

[目的]为提高农杆菌介导的银杏遗传转化效率提供参考。[方法]以成熟的银杏种子胚为外植体,在无激素MS培养基上预培养48h后,采用3种农杆菌介导将GUS基因导入银杏胚中,经过组织化学染色法检测到GUS瞬时表达活性,对影响GUS基因表达的因素进行初步分析;并构建了银杏内酯前体合成途径上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的表达载体。[结果]该研究得到较合适的遗传转化方案,即用银杏胚作为外植体,用携带pCAMBIA1304+的EHA105农杆菌进行侵染,共培养3d,进行GUS染色,结果显示转化后GUS阳性率较高。[结论]该研究为进一步的银杏转基因研究工作奠定了基础。

刚地弓形虫DXR基因的克隆表达与生物学特性分析

目的对刚地弓形虫1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(TgDXR)基因进行克隆、表达、纯化和生物学特性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取cDNA和基因组DNA;PCR扩增TgDXR的基因片段;构建成熟TgDXR/pET-24b重组原核表达载体;经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达。亲和层析纯化重组TgDXR蛋白,并对该蛋白的生物学特性和酶的动力学活性进行分析。结果从弓形虫RH株的cDNA和基因组DNA中分别扩增出长度为1 542bp和5 464bp的TgDXR片段,成功构建重组质粒;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌中高效表达。重组蛋白的相对分子量约50kDa。酶活性实验显示,Mg2+、Mn2+是最佳金属螯合离子,反应最佳pH值为7.5,该酶活性抑制剂膦胺霉素(Fosmidomycin)对该酶蛋白的IC50为0.52μmol/L。结论 RH株刚地弓形虫TgDXR可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有生物学活性,并有望作为弓形虫特异性药物靶标。

阳春砂HMGR和DXR在烟草中单独及共同过量表达调控萜类化合物的生物合成

目的:HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的关键酶,本研究探讨阳春砂AvHMGR和AvDXR在转基因烟草中的过量表达对不同萜类化合物生物合成的影响。方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析AvHMGR和AvDXR的表达水平,应用专一底物法测定HMGR和DXR的酶活性,利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测不同萜类化合物的变化。结果:AvHMGR或AvDXR单独过量表达抑制了HMGR和DXR的活性,提高了五针松烯、新植二烯、薄荷烯和甾醇的含量;而AvHMGR和AvDXR共同过量表达对不同植株中酶活性的影响有差异,提高了甾醇和植醇的含量,但抑制了新植二烯的积累。结论:AvHMGR和AvDXR单独或共同过量表达对烟草中不同萜类化合物的合成调控存在差异,同时也证明了MVA和MEP途径并不完全独立,而是有着相互交流,本研究为利用阳春砂AvHMGR和AvDXR进行萜类化合物的代谢调控提供了依据。

虚拟病例教学软件PUMC-DxR Clinician的初步试用和评估

目的探索虚拟病例教学软件在国内医学教育中的应用。方法在医学生中募集志愿试用者41名(见习生23名和实习生18名),对PUMC-DxR Clinician软件进行为期5周的试用,共10份虚拟病例。试用结束后,填写软件试用评估问卷。结果试用者总体评价(3.71±0.72)分,新颖性(4.66±0.62)分,易用性(3.51±0.87)分,实用性(4.00±0.87)分,各项得分均显著大于3分。适用场景及人群方面,95.1%的试用者赞成用于见习、实习或初年住院医生;80.5%赞成用于教学。结论 PUMC DxR Clinician虚拟病例教学软件在本次试用中体现了较好的实用性和易用性,其价值主要体现在临床思维的培养。

DxR临床思维软件使用分析

正确的临床思维对于医学生至关重要。对于临床思维的培训有多种方式,我们采用DXR临床软件,使用软件里面包含的真实病例对学生进行训练及考核;并对规培教师进行问卷调查;发现DXR临床思维软件存在诸多问题。

牛巴贝斯虫DXR酶的结构特征分析

利用反转录PCR方法扩增牛巴贝斯虫陕县株DXR基因,对其推导氨基酸序列进行生物信息学分析。研究牛巴贝斯虫DXR酶的结构,并探讨其是否可以作为磷胺霉素的作用靶点。结果表明:该基因编码框长度为1 152bp,编码383个氨基酸,与NCBI上公布的美国牛巴贝斯T2Bo株DXR的相似性为97.4%。同源模建表明,DXR酶的三维结构同恶性疟原虫的三维结构相似,与磷胺霉素结合位点氨基酸具有保守性。

农杆菌介导银杏遗传转化体系的建立及Gb-DXR基因表达载体的构建(摘要)(英文)

[目的]为提高农杆菌介导的银杏遗传转化效率提供参考。[方法]以成熟的银杏种子胚为外植体,在无激素MS培养基上预培养48 h后,采用3种农杆菌(C58C1、LBA4404和EHA105)介导将GUS基因导入银杏胚中,经过组织化学染色法检测到GUS瞬时表达活性,对影响GUS基因表达的因素进行初步分析;并构建了银杏内酯前体合成途径上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)的表达载体。[结果]该研究得到较合适的遗传转化方案,即用银杏胚作为外植体,用携带pCAMBIA1304+的EHA105农杆菌进行侵染,共培养3 d,进行GUS染色,结果显示转化后GUS阳性率较高。[结论]该研究为进一步的银杏转基因研究工作奠定了基础。

山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR基因的克隆和SNP分析

在转录组测序结果分析基础上,以山鸡椒c DNA为模板,克隆得到山鸡椒1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原异构酶DXR基因c DNA全长,以山鸡椒基因组DNA为模板,设计引物、扩增拼接后获得山鸡椒DXR基因全长,命名为Lc DXR。序列分析表明,Lc DXR c DNA全长为1 501 bp,5’非编码区长34 bp,3’非编码区长53 bp,开放阅读框长1 413 bp,预测编码含有470个氨基酸残基的蛋白质,等电点为6.62,分子量为51.12 k D。Lc DXR基因全长为12 601bp,其中外显子12个,内含子11个。对来自10个种源的Lc DXR基因编码区单核苷酸变异位点进行分析表明:在c DNA区间内共发现10个SNP(single nucleotide polymorphism)位点,其中有4个单核苷酸变异导致了所编码的氨基酸的改变,为了分析氨基酸突变导致的蛋白质精细结构的变化,利用Swiss-PDB Viewer模拟4个突变位点氨基酸残基的替换。其中江西安远(AY)的突变Lys119Thr引起了氢键的变化,推测可能对酶的活性产生影响。研究结果为深入研究山鸡椒脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶的活性和功能奠定了基础,同时为山鸡椒遗传育种提供理论依据。

过量表达DXR基因提高青蒿中青蒿素的含量

青蒿素是从菊科植物青蒿地上部分提取的一种含过氧桥结构的倍半萜类物质,是治疗疟疾最有效的药物。青蒿素在青蒿中的含量较低。为了提高青蒿素含量,根据GenBank上公布的青蒿素生物合成途径中关键酶基因DXR的编码区序列,从青蒿叶片cDNA中克隆了DXR基因并将其构建到植物表达载体pFSN中。通过根癌农杆菌介导转化青蒿,获得14株转基因青蒿,经PCR鉴定外源基因已插入青蒿基因组中。采用HPLC-ELSD方法对青蒿素含量进行测定,转基因青蒿中青蒿素含量最高达到野生型的2.84倍,证明了过量表达DXR基因能够有效提高青蒿中青蒿素的含量。

洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性的影响

HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀(MEV)和膦胺霉素(FSM),测定烟草Nt HMGR、Nt DXR、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明,抑制剂处理后烟草内源基因Nt HMGR和Nt DXR表达量在24h受到明显抑制;HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。

DxR Clinician模拟教学在血液科临床实践中的应用初探

通过在血液科实施DxR Clinician(简称:DxR)模拟教学,了解医学生对其认可程度,评价其在血液内科实习中的教学效果。选择在同济大学附属同济医院的14级和15级74名实习学生为研究对象,该研究为前瞻性研究,从初期结果看,大部分学生对DxR模拟教学给予了肯定的评价,其作为一种教学方法的补充是可行的,但仍需要干预性验证。

红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因dxr的克隆与分析

近几年的研究表明 ,非甲羟戊酸途径可能是紫杉醇合成的主要途径 ,通过对各种不同来源的非甲羟戊酸途径关键酶 5_磷酸脱氧木酮糖还原异构酶 (DXR)基因同源区域进行比较 ,设计出简并引物 ,利用RT_PCR技术从中国红豆杉 (Taxuschinensis)悬浮细胞中扩增出 5 35bp的基因片段。同源序列比对发现 ,推断的蛋白质序列与Arabi dopsisthaliana (Q9XFS9)、Menthaxpiperita (Q9XES0 )、Synechococcuselongatus (Q8DK30 )、Synechocystissp .PCC 6 80 3(Q5 5 6 6 3)、Nostocsp .PCC 71 2 0 (Q8YP4 9)、Synechococcusleopoliensis (Q9RKT1 )的一致性分别达到 95 %、94 %、80 %、78%、78%和 73%。结合蛋白质保守区、特征区以及进化树分析 ,证实该基因确为dxr基因 。

基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析

为研究烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因的表达模式和功能,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种红花大金元中克隆了NtDXR基因,并通过荧光定量PCR技术分析了NtDXR在红花大金元不同发育时期、不同组织中的表达模式。同时利用CRISPR/Cas9技术构建了NtDXR敲除载体,获得了DXR基因突变的植株。结果表明:NtDXR基因在花中的表达量最高,在雌蕊和叶中次之;利用CRISPR/Cas9系统定点敲除NtDXR基因后,检测目的基因靶位点序列发现有碱基的插入、缺失与置换,并且部分T_0代转基因阳性植株呈现白化表型,暗示NtDXR基因在烟草叶绿素等色素合成过程中起重要作用,推测NtDXR基因的突变能阻断烟草质体色素的合成。