Ena/VASP家族对人巨核细胞白血病Dami细胞中GPIb-IX复合物表达的影响

目的:探索Ena/VASP家族对人巨核细胞白血病Dami细胞中GPIb-IX复合物表达的影响。方法:设计合成针对Ena/VASP家族的Enah、EVL及VASP 3个基因的干扰siRNA,通过Lipofectamine^(TM) 2000转染人巨核细胞白血病Dami细胞株,培养48 h后收取细胞,利用qRT-PCR、Western blot和流式细胞术等方法检测巨核细胞中GPIb-IX复合物的表达情况。结果:构建了Ena/VASP家族基因干扰效果较佳的Dami细胞株。在敲减Enah、EVL及VASP基因表达后,在mRNA水平上,巨核细胞中GPIb-IX复合物的表达无明显变化;在总蛋白和膜表面蛋白水平上,敲减Enah后,巨核细胞中GPIb-IX复合物表达明显降低。结论:Enah基因可能对人巨核细胞白血病Dami细胞中GPIb-IX复合物的表达有影响,但是具体机制仍需要进一步探索。

过氧化氢诱导人巨核细胞系Dami氧化应激模型的建立及评价

目的探讨过氧化氢(H2O2)诱导Dami细胞氧化应激模型的条件,建立并评价模型。方法不同浓度过氧化氢处理Dami细胞后,Giemsa染色,显微镜观察细胞形态学的变化;CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,绘制生长曲线,计算半数抑制浓度(IC50);加载DCFH-DA探针后流式细胞仪检测细胞内活性氧自由基水平;Western blot检测核因子NF-E2相关因子(Nrf2)、醌氧化还原酶(NQO1)、血红素加氧酶(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)表达量。结果随着H2O2浓度升高,Dami细胞核皱缩趋于明显,存活率下降,IC50为(0.9132±0.144)mmol/L;0.1 mmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L H2O2处理Dami细胞2 h,细胞氧化应激阳性率分别为12.11%、20.91%、52.53%;H2O2处理Dami细胞24 h后,抗氧化蛋白Nrf2、GCLC水平升高,未检测到HO-1和NQO1的表达。结论 1 mmol/L H2O2是建立Dami细胞氧化应激模型的合适浓度。Dami细胞抗氧化应激反应与Nrf2/ARE通路有关。

白细胞介素13诱导Dami细胞分化并下调转录因子c-myc表达

目的:研究重组人白细胞介素13(recombinant human interleukine-13,rhIL-13)对巨核细胞白血病细胞株Dami细胞分化的影响,以及Dami细胞白细胞介素13受体α1(Interleukine-13receptor alpha1,IL-13Rα1)的表达,探讨IL-13诱导Dami细胞分化的机制。方法:Dami细胞经无血清培养20小时后,以rhIL-13分别作用不同时间,提取总RNA,用RT-PCR检测Dami细胞IL-13受体α1mRNA、GPⅡb mRNA、c-myc mRNA表达水平。流式细胞仪检测在rhIL-13作用下,Dami细胞GPⅡb表达。免疫组化法检测在rhIL-13作用下,Dami细胞c-myc的表达。图像分析仪对结果进行分析。结果:①Dami细胞表达IL-13Rα1mRNA,rhIL-13作用Dami细胞4小时,IL-13Rα1mRNA表达降低,12小时IL-13Rα1mRNA表达恢复。②rhIL-13作用Dami细胞后,巨核细胞的分化标志物GPⅡb mRNA和蛋白质表达增加。③rhIL-13作用Dami细胞,c-myc mRNA和蛋白质表达降低。结论:白细胞介素13下调c-myc表达。

氨磷汀对人巨核细胞白血病Dami细胞增殖及分化的影响

目的探讨氨磷汀(依硫磷酸,Amf)对人巨核细胞白血病Dami细胞分化的影响。方法 Amf0.01~5.0 mmol·L^(-1)分别处理Dami细胞12 d,每天光镜下观察细胞形态,计数Dami细胞数量,绘制增殖曲线;第12天,计数直径>20μm细胞数量,透射电镜观察Dami细胞血小板分界膜系统的形成,流式细胞仪检测细胞DNA倍体化及细胞表面抗原CD33,CD34和CD41a的变化。结果 Amf 0.1~1.0 mmol·L^(-1)促进Dami细胞分化;Amf>1.0 mmol·L^(-1)时抑制Dami细胞增殖,Amf 1.0 mmol·L^(-1)作用12 d后光镜下观察到细胞体积增大,直径>20μm细胞比例增加24.6%(P<0.01);透射电镜观察可见细胞出现血小板分界膜系统;流式细胞仪发现,髓系细胞分化抗原CD33表达减少13.6%;巨核细胞相关分化抗原CD41a表达增加11.9%(P<0.05);DNA倍体分析发现,实验组4N和8N细胞分别增至31.56%和8.83%(P<0.01),并出现16N的超多倍体细胞(3.43%)。结论 Amf>1.0 mmol·L^(-1)时抑制Dami细胞增殖,0.1~1.0 mmol·L^(-1)时诱导Dami细胞向成熟巨核细胞分化。

二甲双胍对巨核细胞白血病细胞株Dami细胞增殖的抑制作用及其机制

目的:研究二甲双胍对巨核细胞白血病细胞株Dami细胞生长的影响,初步探讨二甲双胍抑制Dami细胞增殖的分子机制。方法:将培养的Dami细胞分为空白对照组,1、2、4、8、16和32mmol·L-1二甲双胍处理组;MTT法检测不同浓度二甲双胍作用后Dami细胞增殖抑制率,流式细胞术检测细胞周期分布,免疫印迹分析Cdc2和Cyclin B1蛋白的表达以及Cdc2蛋白的磷酸化修饰。结果:MTT检测,与空白对照组比较,32mmol·L-1二甲双胍处理组0、24、48、72和96h Dami细胞增殖抑制率明显升高[(35.1±2.3)%、(49.7±5.1)%、(78.8±0.9)%、(79.1±3.0)%和(85.2±3.2)%](P<0.01);在二甲双胍处理72h后,1、2、4、8、16和32 mmol·L-1处理组Dami细胞增殖抑制率分别为(33.8±1.3)%、(51.9±2.2)%、(59.4±1.6)%、(65.5±2.0)%、(75.5±0.9%)和(79.1±3.0)%,二甲双胍对Dami细胞的增殖抑制作用呈时间和剂量依赖性。流式细胞术检测,与空白对照组比较,1、2和4mmol·L-1二甲双胍处理组G2/M期细胞比例从(26.0±0.5)%升高至(38.5±1.5)%、(48.4±1.1)%和(58.2±2.7)%,4mmol·L-1二甲双胍处理组G2/M期细胞比例明显高于对照组(P<0.01)。免疫印迹分析,与空白对照组比较,4mmol·L-1二甲双胍处理组Cdc2和Cyclin B1的表达水平明显下降,Cdc2在Try15位点磷酸化明显上调,而在Thr161位点的磷酸化明显下调。结论:二甲双胍能抑制Dami细胞增殖并诱导其发生G2/M期阻滞,其机制可能与Cdc2/Cyclin B1复合物的活化受到抑制有关。

重组人白血病抑制因子体外诱导人巨核细胞白血病DAMI细胞株凋亡与P73蛋白表达

目的探讨重组人白血病抑制因子(rh-LIF)诱导人巨核细胞白血病DAMI细胞株凋亡和P73蛋白表达,探讨其作用机制。方法应用锥虫蓝拒染法、CCK-8法观察不同质量浓度(1～40μg/L)rh-LIF作用6、12、24、48h后对DAMI细胞株增殖及活力影响,用流式细胞仪测定早期凋亡指标Annexin V,免疫组织化学法检测用药前后P73蛋白表达变化。结果低质量浓度(1、2μg/L)rh-LIF对DAMI细胞增殖无明显抑制,诱导凋亡作用不明显,P73蛋白阳性表达低(P>0.05);当质量浓度>5μg/L时其作用随培养时间延长及药物质量浓度增加而增强(P<0.05)。结论低水平rh-LIF对DAMI细胞增殖无明显抑制,高水平rh-LIF抑制DAMI细胞增殖并诱导其凋亡,用药后P73蛋白阳性表达有明显增高。

重组人血小板生成素对巨核细胞系-Dami细胞增殖的影响

为了探讨重组人血小板生成素（ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔｈｕｍ ａｎ ｔｈｒｏｍ ｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，简称ｒｈＴＰＯ）的生物学活性，采用了血浆凝块培养法，５－溴－２′－脱氧尿核苷（５－ＢｒｄＵ）掺入Ｄａｍ ｉ细胞ＤＮＡ－酶联免疫吸附法，研究了ｒｈＴＰＯ对巨核细胞系－Ｄａｍ ｉ细胞增殖的作用。结果发现， 在加有ｒｈＴＰＯ的培养基中， Ｄａｍ ｉ细胞迅速增殖， 集落数量和吸光度值高于对照组。实验组ｒｈＴＰＯ浓度为２５， ５０， １００， ２００ｎｇ／ｍ ｌ， Ｄａｍ ｉ细胞集落增殖率分别为２１．０５％ ，５７．８９％ ，１０５．２６％ ，１２１．０５％ ，吸光度增加率分别为１９．３５％ ，６１．２９％ ，１０３．２３％ ，１１９．３５％ ，ｒｈＴＰＯ促进Ｄａｍ ｉ细胞增殖的作用在一定范围内存在浓度依赖性。研究结果表明， ｒｈＴＰＯ对Ｄａｍ ｉ细胞具有促进增殖的作用。

白细胞介素-13上调巨核细胞系-Dami细胞原癌基因c-mpl的研究

目的 :研究重组人白细胞介素 - 13(rhIL - 13)对巨核细胞系 -Dami细胞原癌基因c -mpl表达的影响。方法 :用RT -PCR法检测c-mplmRNA的表达。用配体结合实验检测膜蛋白c-mpl的表达。结果 :经 2 5 μg/LrhIL - 13处理过的实验组Dami细胞c -mplmRNA的表达比对照组高 2 4 8%。经 10 0 μg/LrhIL - 13处理过的实验组Dami细胞膜蛋白c -mpl的表达比对照组高 2 8 5 % (P <0 0 5 )。结论 :rhIL - 13增强了Dami细胞原癌基因c -mpl表达 ;膜蛋白c-mpl与促血小板生成素 (TPO)的结合功能正常 ;rhIL - 13促进Dami细胞增殖的部分机制可能是通过上调原癌基因c

rhIL-11诱导转录因子GATA-1和NF-E2在Dami细胞的表达

目的探讨重组人白细胞介素11(rh IL-11)对巨核细胞白血病细胞株D am i内转录因子GATA-1和NF-E 2表达的调节作用。方法用rh IL-11(50 ng/m l)刺激D am i细胞1、2、4 h,W estern b lot和RT-PCR法分析rh IL-11诱导D am i细胞GATA-1、NF-E 2 mRNA表达水平。结果rh IL-11可诱导D am i细胞GATA-1、NF-E 2mRNA表达,1 h后作用下降。结论rh IL-11可能通过诱导GATA-1、NF-E 2表达调控巨核细胞生成。

重组人白细胞介素-13对巨核细胞系-Dami细胞原癌基因c-mpl表达的影响

目的 :研究重组人白细胞介素 13 (rhIL 13 )对巨核细胞系 -Dami细胞原癌基因c mpl表达的影响。方法 :实验组细胞培养系统中分别加入 2 5ng/ml,5 0ng/ml,10 0ng/mlrhIL 13 ,对照组不加任何细胞因子。用RT PCR法检测c mplmRNA的表达。结果 :经 2 5ng/ml、5 0ng/ml、10 0ng/mlrhIL 13处理过的实验组Dami细胞较之对照组其c mplmRNA的表达分别提高 2 4 .8%、2 7.9%和 3 1.5 %。结论 :rhIL 13增强了Dami细胞原癌基因c mpl表达 ;rhIL 13促进Dami细胞增殖的部分机制可能是通过上调c mpl的表达来实现的。

氨磷汀对人巨核细胞白血病Dami细胞促分化作用的机制研究

目的:探索氨磷汀对人巨核细胞白血病Dami细胞的促分化作用的机制。方法:采用氨磷汀1 mmol·L^(-1)刺激人巨核细胞白血病Dami细胞系,共诱导12 d,利用RT-PCR及Western blot方法检测在诱导的0、4 d、8 d、12 d时巨核细胞分化相关转录因子GATA-1、NF-E2的表达变化,并通过对Dami细胞进行核质分离以及利用免疫荧光的方法研究两种转录因子在核质中的分布。结果:RT-PCR及Western blot没有检测到巨核细胞分化相关转录因子GATA-1和NF-E2表达水平升高,但入核实验结果表明转录因子NF-E2、GATA-1入核活性增加。结论:氨磷汀诱导Dami细胞向成熟巨核细胞分化是通过增加转录因子NF-E2、GATA-1入核活性而发挥作用。

肿节风总黄酮调节MAPK/JNK信号通路促进巨核细胞分化成熟

目的 基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/c-Jun N-末端激酶(JNK)信号通路探讨肿节风总黄酮对体外巨核细胞分化成熟障碍模型的影响及作用机制。方法 利用终浓度为5 ng·mL^(-1)的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)和体积分数为1%的抗血小板血清(APS)联合作用于Dami细胞,构建体外巨核细胞分化成熟障碍模型。将细胞分为空白对照组、PMA诱导组(5 ng·mL^(-1))、APS模型组(5 ng·mL^(-1)PMA+1%APS)以及肿节风总黄酮高、中、低剂量组(15.6、7.8、3.9μg·mL^(-1)肿节风总黄酮+5 ng·mL^(-1)PMA+1%APS)。分别于培养48、72、96 h后,采用化学发光法检测细胞增殖活力。培养96 h后,采用流式细胞术检测各组Dami细胞的巨核细胞表面标志物CD41a、CD42b和CD61表达情况;采用Western Blot法检测Dami细胞MAPK/JNK信号通路关键蛋白p-JNK、JNK、p-c-Jun、c-Jun的表达情况。结果 (1)与空白对照组相比,PMA诱导组不同时间点的细胞活力均显著降低(P<0.01);与PMA诱导组相比,APS模型组48 h的细胞活力明显下降(P<0.05),但随时间延长抑制作用减弱,72、96 h的差异无统计学意义(P>0.05);与APS模型组比较,肿节风总黄酮中、高剂量组48、72 h的细胞活力均受到明显抑制(P<0.05,P<0.01),肿节风总黄酮高剂量组96 h的细胞活力受到显著抑制(P<0.01)。(2)与空白对照组比较,PMA诱导组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著升高(P<0.01)。与PMA诱导组比较,APS模型组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著降低(P<0.01);p-JNK/JNK及p-c-Jun/c-Jun蛋白表达显著上调(P<0.01)。与APS模型组比较,肿节风总黄酮高、中剂量组Dami细胞表面的CD41a、CD42b和CD61表达水平均显著升高(P<0.01),细胞p-JNK/JNK蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01);肿节风总黄酮低、中、高剂量组Dami细胞p-c-Jun/c-Jun蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论 肿节风总黄酮可能通过调节MAPK/JNK信号通路来改善巨核细胞分化成熟障碍。

血小板衍生生长因子BB在川崎病血小板增多中的作用及机制研究

目的通过体内外实验探究血小板衍生生长因子BB(platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)对川崎病(Kawasaki disease,KD)小鼠和人巨核细胞株Dami细胞生成血小板的作用及机制。方法ELISA检测KD及健康儿童各40例血清PDGF表达水平。C57BL/6小鼠构建KD模型,随机分为正常组、KD组、伊马替尼组,每组30只。检测各组血常规及PDGF-BB、巨核细胞集落形成单位(megakaryocyte colony forming unit,CFU-MK)、巨核细胞标记物CD41表达。采用CCK-8、流式细胞术、实时定量PCR、Western blot检测PDGF-BB对Dami细胞生成血小板的作用和机制。结果PDGF-BB在KD患儿血清中高表达(P<0.001)。KD组小鼠血清PDGF-BB高表达(P<0.05)、CFU-MK及巨核细胞标记物CD41表达增加(P<0.001);伊马替尼组CFU-MK及CD41表达减少(P<0.001)。体外实验结果显示,PDGF-BB促进Dami细胞增殖、血小板生成、PDGFR-βmRNA及p-Akt蛋白表达(P<0.05);联合组(PDGF-BB 25 ng/mL+伊马替尼20μmol/L)血小板生成、PDGFR-βmRNA和p-Akt蛋白表达少于PDGF-BB组(P<0.05)。结论PDGF-BB可能通过与PDGFR-β结合,激活PI3K/Akt通路,促进巨核细胞增殖、分化及血小板生成;PDGFR-β抑制剂伊马替尼可减少血小板生成,为KD血小板增多的诊疗提供了新的策略。

重组融合蛋白rTMP-GH对体外培养巨核细胞增殖的影响

目的探讨TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(growth hormone,GH)的重组融合蛋白rTMP-GH对体外培养巨核系细胞增殖的影响,以及对血小板生成有显著调控作用的球蛋白转录调节因子(globin transcription factor-1,GATA-1)表达的调控作用。方法体外培养Dami细胞,100ng/ml的重组融合蛋白rTMP-GH作用7d后,观察巨核细胞集落形成能力,分析rTMP-GH对Dami细胞增殖的影响。同时,采用Western blot和RT-PCR方法分别检测Dami细胞中GATA-1的蛋白水平和mRNA表达变化,探讨rTMP-GH对巨核细胞生成血小板的调节作用。结果rTMP-GH处理后Dami细胞的集落形成能力显著增强,转录因子GATA-1的mRNA和蛋白表达水平显著上调,其调节作用明显强于空白对照组和GH组。结论rTMP-GH能够刺激巨核细胞增殖分化和上调GATA-1的表达,具有促进血小板生成的作用。

酪氨酸激酶抑制剂A77-1726阻断IL-13介导STAT6磷酸化和c-fos表达

目的研究酪氨酸激酶抑制剂A77-1726对IL-13介导Dami细胞STAT6磷酸化和c-fos表达的影响,为A77-1726的临床应用和IL-13的信号通路研究提供新的实验依据。方法提取Dami细胞总RNA,RT-PCR检测c-fos mRNA表达。提取Dami细胞总蛋白,Western blot检测磷酸化STAT6和c-fos蛋白表达。凝胶定量软件Quantity One检测电泳条带光密度,统计学分析。结果100μg·L-1IL-13作用Dami细胞,可见STAT6磷酸化,50μmol·L-1A77-1726可阻断IL-13诱导的Dami细胞STAT6磷酸化。IL-13作用Dami细胞,c-fos mRNA表达增高(P<0.05),50μmol·L-1A77-1726阻断了IL-13诱导的Dami细胞c-fos mRNA的表达(P<0.05)。IL-13促进Dami细胞c-fos蛋白表达(P<0.05),50μmol·L-1A77-1726作用Dami细胞,阻断了IL-13诱导的c-fos蛋白表达(P<0.05)。结论酪氨酸激酶抑制剂A77-1726阻断了IL-13介导的白血病Dami细胞STAT6磷酸化和c-fos表达,JAK/STAT6通路是IL-13信号通路之一,IL-13诱导的c-fos表达与STAT6通路相关。

免疫细胞化学法检测ITP病人血清血小板抗体

目的 :建立新的原发性血小板减少性紫癜 (ITP)病人的血清学检测方法。方法 :采用免疫细胞化学法 ,用巨核细胞 血小板系Dami细胞株进行涂片 ,利用Dami细胞膜上的表面标志物GpⅡb/Ⅲa、GpⅠb、vWF等作为抗原 ,检测ITP病人血清中的血小板自身抗体。结果 :部分Dami细胞内可见红色沉淀颗粒 ,颗粒着色深浅不一 ,部分Dami细胞胞膜呈红色 ,ITP病人组红色沉淀颗粒明显多于正常人组和非ITP性血小板减少组。结论

白细胞介素13诱导Dami细胞STAT6磷酸化及上调GPⅡb表达

目的研究重组人白细胞介素13(rhIL-13)诱导巨核细胞白血病细胞株Dami细胞STAT6(signal transducers and activators of transcription 6)磷酸化及对Dami细胞GPⅡb表达的影响。方法RT-PCR检测Dami细胞IL-13Rα1 mRNA、IL-4RαmRNA和GPⅡb mRNA;Western blot检测Dami细胞磷酸化STAT6蛋白表达;流式细胞仪检测Dami细胞GPⅡb蛋白表达。结果Dami细胞表达IL-13 Rα1 mRNA;Dami细胞表达IL-4RαmRNA;IL-13作用Dami细胞2 h,STAT6磷酸化;IL-13组Dami细胞GPⅡb表达高于空白对照组(P<0.05)。结论IL-13诱导Dami细胞STAT6磷酸化并上调Dami细胞GPⅡb表达。