白酒大曲中产香微生物筛选及提升再造烟叶品质研究

针对再造烟叶香气质较差的问题,从广西特香型白酒大曲中筛选能够利用再造烟叶萃取液中营养物质发酵产香的微生物,结合形态学及分子生物学方法对产香效果最佳的微生物进行菌株鉴定及发酵条件优化,利用GC-MS技术测定其产香的物质基础,并将其添加于再造烟叶中进行感官评价。结果表明:筛选出的Y-1菌株对再造烟叶萃取液中可溶性糖和蛋白质的利用能力最强,对萃取液的香气改善效果最佳;经鉴定,Y-1菌株为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii),其在25℃、pH值为5、体积分数为80%的再造烟叶萃取液中发酵24 h后,能够显著提升萃取液中酯类、酮类、醇类和酸类等挥发性香气物质的含量,提升幅度分别达2.31倍、0.66倍、12.15倍和2.74倍,且萃取液中新增16种挥发性香气物质;Y-1菌株发酵萃取液添加于再造烟叶后,能显著增强其果香、甜香感及香气层次感,提升其吸味品质。

不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响

大曲是中国传统白酒典型的“多酶多菌”的发酵剂。免培养的分子生物学方法已经成为大曲微生物群落研究的常规方法。通过评估不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响,选择适合用于大曲DNA提取的最佳方法。该研究选择4种DNA提取方法分别对2种大曲进行大曲微生物DNA的提取,结合DNA提取质量、qPCR定量结果、细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因扩增子文库的Illumina Miseq测序结果,评估大曲基因组DNA不同提取方法的效果。从DNA得率和生物量的综合分析表明,SDS-based提取法的DNA得率高于试剂盒提取法,其中原位SDS-based提取法DNA得率高达5.46×10^(4)ng/g,但DNA纯度较低;SDS-based提取法的qPCR定量结果比试剂盒提取法高10^(1)~10^(6)量级,其中洗脱加SDS-based提取法的微生物生物量最高,比原位SDS-based提取法的生物量高10^(1)~10^(3)量级;试剂盒提取法的微生物生物量最低,细菌和真菌的生物量只有10^(2)~10^(4)copies/g。扩增子文库间Shannon多样性指数的比较结果表明,不同DNA提取方法在真菌ITS扩增子文库间存在显著差异,而在细菌16S rDNA扩增子文库间差异不显著。洗脱处理样本的真菌扩增子文库Shannon指数要高于原位处理的样本。通过对扩增子文库间存在显著性差异操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的比较可以看出,在细菌16S rDNA扩增子文库中,多数OTUs存在丰度差异,但它们大多数能在不同DNA提取方法中检测到;然而在真菌ITS扩增子文库间,少数OTUs在不同DNA提取方法中检测不到,说明DNA提取方法对部分真菌微生物基因组的提取存在显著影响,且洗脱处理有利于真菌基因组DNA的提取。综合对比4种DNA提取方法,洗脱加SDS-based提取法最适合用于大曲微生物的定量和群落结构分析。

包包曲风味萃取方式的对比及GC×GC-TOFMS在其风味化合物鉴定中的应用

包包曲是五粮液酿造独具特色的糖化发酵剂,分析包包曲中的风味成分对生产控制具有重要意义。本研究采用液液萃取(LLE)、溶剂辅助风味蒸发(SAFE)、顶空固相微萃取(HS-SPME)等方法对包包曲中的风味成分进行萃取,并进一步利用全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)对化合物进行分析,以建立最有效的包包曲风味分析方法。结果表明,LLE法共提取化合物316种,在总峰面积、化合物数量及低含量化合物的检出方面具有优势;干法HS-SPME萃取效果优于湿法HS-SPME,两者对醛类表现出良好的吸附性;半定量结果显示,包包曲中数量最多、含量最高的是醇类,2,3-丁二醇、苯乙醇、丙二醇、醋酸、己酸、丁内酯等化合物在包包曲中相对含量较高。本研究可为包包曲乃至酒曲的风味研究提供有效参考。

汾酒大曲和酒醅样品DNA提取方法的优化

以汾酒不同发酵时期的酒醅、不同制作过程中的酒曲以及制曲环境样品为材料,采用酶物理化学法与物理化学法两种方法对不同样品DNA进行提取,实验结果表明,采用酶物理化学法获得了质量及纯度较好的DNA。后续实验表明,酶物理化学法提取获得的高质量DNA能全面反映汾酒酿造过程中的微生物群落结构多样性。

洋河大曲主要菌系的研究

对洋河大曲3种大曲浸提液主体微生物区系进行研究。结果表明,洋河大曲中的细菌种类最为丰富,共分离到15株,其中芽孢杆菌属6株;霉菌12株,其中,曲霉属6株,该种类较丰富,但其在数量上并不具优势;分离到酵母菌8株,其中,毕赤酵母属3株,其数量占酵母菌总数的80%左右;洋河大曲与传统浓香型大曲中的主体微生物菌系之间存在一定的差异性。

高温大曲中细菌总DNA提取方法比较

研究了5种基于不同裂解机理的提取方法对高温大曲中总基因组提取效果的影响。结果表明,基于SDS-酶法裂解原理的提取方法获得的结果最优,此方法获得的总基因组片段大约为21kb;纯度为:A260/A280=1.762,A260/A230=1.587;并且能不经纯化直接用于16SrDNA的扩增。为利用16SrDNA分析等后续一系列的分子生物学技术操作打好基础,使得利用先进的分子生物学技术对大曲微生物的研究成为可能。

芝麻香型白酒高温大曲微生物总DNA提取的改良方法

从常温研磨、蛋白酶K和R nase的加入对传统CTAB法进行改良,并结合试剂盒法,提出了一种高效提取高温大曲微生物总DNA的方法。该方法获得的总基因片段大小约21Kb;A260/A280=1.878;A260/A230=1.706;PCR反应抑制物少,可直接用于16S rDNA的扩增;并通过构建克隆文库技术和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析后发现高温大曲中细菌多样性丰富,能一定程度上反映微生物群落结构和组成。研究结果表明该方法提取的DNA适用于芝麻香高温大曲中微生物的分子生态学研究。

响应面法优化大曲中黄曲霉毒素B1提取工艺

该研究利用单因素试验和响应面法对大曲中黄曲霉毒素B1(AFB1)的提取条件进行优化,分别考察了甲醇体积分数、超声波提取功率、提取时间和提取温度对AFB1提取效果的影响。结果表明,大曲中AFB1的最佳提取工艺为甲醇体积分数55%、超声波功率为200 W、提取时间为25 min、提取温度30℃。在此最优条件下,AFB1得率为2.58μg/kg,可为大曲中AFB1的提取提供简便、准确、可靠的分析方法。

中高温大曲中的挥发性成分分析

采用索氏提取法对浓香型中高温大曲中的挥发性成分进行提取,并应用气质联用技术对提取物进行定性分析研究。结果表明,从大曲中共检测出主要成分39种,其中含氮化合物8种、醇类化合物7种、有机酸类化合物10种、酚类化合物4种、酯类化合物2种、含氧杂环类化合物3种、烷烃类化合物2种、芳香族化合物1种、酮类化合物2种。其中,四甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚和苯乙醇对大曲的香气有重要贡献。

正交法优化酱香型大曲类黑素提取工艺

为了优化提取酱香型大曲类黑素的工艺条件,采用L9(34)正交设计,以酱香型大曲为提取原料,以乙醇溶液为提取溶剂,以类黑素浓度为考察指标,研究了提取浓度、提取温度、液固比和提取时间等单因素对提取效果的影响。结果表明,提取浓度、提取温度、液固比和提取时间对类黑素终浓度的影响均达到显著水平,其影响程度为液固比>提取浓度>提取时间>提取温度。确定酱香型大曲类黑素最佳提取条件为:提取温度70℃,提取浓度40%,提取时间3 h,液固比17.5∶1。可作为深入研究酱香型大曲的基础。

十个浓香型大曲挥发性风味物质的主成分分析

研究浓香型大曲的主要挥发性风味物质,并根据这些化合物对大曲风味做初步评定,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(SPME-GC-MS)技术检测大曲中的挥发性物质,用乙酸丁酯作为内标物,半定量这些化合物的含量,并用主成分分析法对挥发性物质和大曲样进行分析。结果显示:从10个大曲样品检测出46种挥发性风味物质,主要以酯类、吡嗪类、芳香类为主;主要的挥发性化合物是2,3,5-三甲基吡嗪、十四酸乙酯、1-苯基-2-丙醇、2,5-二甲基吡嗪、棕榈酸乙酯、2,3,5,6-四甲基吡嗪等;对10个大曲样本进行主成份分析,6号样风味最好,10号样其次,1号风味最差。通过对大曲中主要挥发性风味物质研究,可为大曲风味质量判断提供一定的理论参考价值。

董酒大、小曲浸提液对酿酒微生物发酵产不饱和脂肪酸的影响

董酒小曲中添加了90多味丰富的中药材,大曲中添加了40多味。分别以其为原料制备浸提液,作为酵母菌液态发酵的添加液,通过设立实验组(添加小曲浸提液)和对照组(不添加小曲浸提液)进行实验,30℃恒温发酵10 d,10 d后取实验组和对照组的发酵液分别进行甲酯化处理,随后进行气相色谱分析,测定溶液中肉豆蔻油酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸这5种不饱和脂肪酸的含量。实验结果表明,实验组中的5种不饱和脂肪酸的含量明显比对照组高,说明董酒酒曲对发酵过程中的不饱和脂肪酸的形成有一定的贡献作用。

超声提取和固相微萃取在提取白酒大曲成分方面的应用

研究使用恒温超声提取机结合固相微萃取技术提取白酒大曲中的微量成分,通过对不同提取溶剂的选择以及各种不同萃取头提取效果的研究,最终确定了一种有效的白酒大曲微量成分研究方法。

响应面法优化大曲中呕吐毒素提取工艺

以大曲为主要原料,对大曲中呕吐毒素的提取工艺进行了研究。通过单因素试验结论,采用响应面法对大曲中呕吐毒素(DON)的提取工艺进行优化,分别考察了甲醇体积分数、超声波提取功率、超声波提取时间和离心速度对DON提取效果的影响。结果表明,大曲中DON的最佳提取工艺为:甲醇溶液体积分数53%,超声波提取时间200W,提取时间25min,离心速度为4900r/min。在此最优条件下,大曲中DON得率为243.8ppb,与预测值基本相符,证明该模型可靠。

大曲酒糟中纤维素提取工艺的优化

酒糟中含有大量的稻壳、淀粉等可再利用的能源物质,并且产量大,造成我国特有农产品深加工的沉重负担,但也有巨大的再利用的潜力。因此,为有效的再利用酒糟,本研究以大曲酒糟为研究对象,考察了纤维素提取工艺中碱浓度、碱水解温度和料液比等多方面因素对纤维素提取的影响。结果表明:纤维素的提取率及纯化程度主要受碱浓度的影响。大曲酒糟纤维素提取优化条件为:NaOH浓度0.5mol/L,料液比1:11,碱水解温度60℃。

河套浓香型大曲微生物区系研究

采用传统微生物分离方法对河套浓香型大曲进行菌种分离、纯化;对分离得到的菌种采用分子生物学技术(DNA提取及PCR扩增、PCR产物纯化、序列测定和blast序列比对等)完成菌种鉴定,进一步分析研究河套浓香型大曲中的微生物区系。

酶联免疫法测定大曲酯化酶活力的条件优化

利用酶联免疫法(ELISA)对大曲中酯化酶活力进行测定,并对影响酯酶提取的关键参数进行研究分析。结果表明,声辐射时间为3s,总反应时间为7min,间歇时间为3s,超声提取功率为300W,溶液体积为30mL,料液比参数为1.0∶100为酯酶最佳的提取条件。

大曲中酶蛋白提取条件研究

大曲药作为白酒生产重要的菌酶混合制剂,为后续的窖池发酵提供了主要的酶制剂来源。针对浓香型春季大曲,以液化酶酶活力作为参考指标,研究了水溶液浸提的pH、温度、料液比、提取时间等条件,经正交实验并验证,得到了提取的最佳条件为pH6.0、温度30℃、料液比1:2、提取时间2 h。对提取物料处理方式进行了研究,对浸提液进行超声波破碎处理有利于产孢子微生物分泌的纤维素酶的释放。对于液化酶、糖化酶、中性蛋白酶等主要是细菌来源酶类,物料、浸提液进行超声波破碎处理,均没有显著效果。