左旋多巴诱导帕金森病异动症与纹状体DARPP-32磷酸化的关系

目的观察帕金森病(PD)异动症(LID)大鼠模型纹状体区多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)蛋白Thr75位点磷酸化表达数量及表达位点的改变。方法给予PD大鼠模型左旋多巴治疗21d,评估大鼠行为学变化;采用免疫荧光和Western blot检测大鼠纹状体区DARPP-32蛋白Thr75位点磷酸化表达数量和表达部位的改变情况。结果 PD大鼠长期使用左旋多巴出现类似于人类LID行为学表现。免疫荧光结果显示PD组和LID组大鼠损伤侧DARPP-32(Thr75)的表达多位于强啡肽阳性神经元。Western blot结果显示PD组大鼠损伤侧DARPP-32(Thr75)表达为(159.90±7.22)%,与假手术组比较升高(P<0.05);LID组大鼠损伤侧纹状体DARPP-32(Thr75)的表达为(52.60±4.45)%,与假手术组和PD组比较降低(P<0.05)。结论纹状体黑质投射神经元内DARPP-32蛋白Thr75位点磷酸化表达的改变可能参与了LID的发病。

异动症大鼠直接通路中DARPP-32蛋白变化的机制

目的:观察左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠模型行为学特点及DARPP-32蛋白的磷酸化状态的变化,探讨LID的发生机制。方法:复制成功的帕金森病(Parkinson′sdisease,PD)大鼠应用左旋多巴治疗28d诱发LID大鼠模型,进行异常不自主运动(abnormalinvoluntarymovement,AIM)评分,并采用逆转录聚合酶链式反应及免疫印迹技术检测LID大鼠纹状体内总DARPP-32的mRNA与蛋白表达及其Thr-34位点磷酸化水平。结果:LID大鼠模型复制成功后出现了与人类LID相似的对侧前肢、躯干和口面部AIM,并随左旋多巴治疗时间的延长而加重。LID大鼠Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平较对照组及左旋多巴治疗组明显增高,差异均有显著性意义(P<0.01)。结论:长期间断性给PD大鼠左旋多巴能复制出LID大鼠模型,DARPP-32的Thr-34位点的磷酸化水平的改变是LID时多巴胺D1受体介导的直接通路异常活化的关键因素之一。

异动症大鼠模型基底节DARPP-32蛋白磷酸化状态的变化

目的观察左旋多巴诱发异动症(LID)大鼠模型行为学特点及DARPP-32蛋白的磷酸化状态的变化,探讨LID的发生机制。方法复制成功的帕金森病(Parkinson disease PD)大鼠应用左旋多巴治疗28d诱发LID大鼠模型,进行异常不自主运动(abnormalinvol untary movement,AIM)评分,并采用免疫印迹技术检测LID大鼠纹状体内DARPP-32蛋白Thr-34位点磷酸化水平。结果LID大鼠模型复制成功后出现了与人类LID相似的对侧上肢、躯干和口面部异常不自主运动(AIM),并随左旋多巴治疗时间的延长而加重。LID组大鼠纹状体内Thr-34位点磷酸化的DARPP-32水平较对照组与左旋多巴治疗组明显增高,又以重度LID组大鼠更为显著,差异有显著性意义(P<0.01)。结论慢性间断性给PD大鼠左旋多巴能复制出LID大鼠模型,其纹状体区DARPP-32蛋白的磷酸化状态发生了改变,与LID的发生可能有关。

纹状体A_(2A)R/D_2DR表达及DARPP-32磷酸化在运动疲劳调控中的作用

目的通过观察跑台运动大鼠力竭前后纹状体腺苷A2A受体/多巴胺D2受体(A2AR/D2DR)表达、磷蛋白DARPP-32表达及其磷酸化,探讨A2AR/D2DR通过纹状体-苍白球通路对运动疲劳调控的可能机制,为寻求新的抗疲劳药物及手段提供理论与实验依据。方法实验选用8周龄雄性健康Wistar大鼠30只,随机分为安静对照组(CG)、力竭即刻组(EG)和力竭后恢复90 min(RG)组,每组10只,建立一次性力竭运动疲劳模型。采用免疫荧光双标技术,观察大鼠安静状态、力竭即刻及恢复90 min时纹状体A2AR和D2DR表达的变化;采用免疫荧光和免疫印迹技术,观察大鼠在安静状态、力竭即刻及恢复90 min时纹状体苍白球神经元(D2-MSNs)内DARPP-32表达及磷酸化水平的变化特征。结果大鼠跑台运动至力竭时纹状体A2AR阳性细胞个数显著增高(P<0.01),D2DR阳性细胞个数显著下降(P<0.01),且A2AR和D2DR共表达于D2-MSNs的胞膜上;恢复90 min时A2AR阳性细胞依然显著高于安静状态(P<0.05),D2DR依然低于安静状态(P<0.05);相比安静状态,力竭运动即刻Thr34-DARPP-32磷酸化增加(P<0.01),恢复90 min时表达显著下降(P<0.05),p-Thr34-DARPP-32/DARPP-32比值增加(P<0.01),恢复90 min后有所下降,但没有显著性差异。结论 A2AR和D2DR共同参与了对运动中枢疲劳的调控;大鼠力竭运动过程中,A2AR和D2DR是通过调节Thr34-DARPP-32磷酸化程度而发挥对运动疲劳的调控作用;运动至力竭时A2AR和D2DR调节作用异常,可能是运动疲劳时纹状体神经元异常兴奋的原因之一。

缺血引起沙土鼠纹状体DARPP-32磷酸化状态的变化

采用蒙古沙土鼠双侧颈总动脉阻断前脑缺血模型 ,以放射自显影 (反向磷酸化 ,back phosphorylation)及免疫印迹 (Westernblotting)法体外测定缺血时纹状体DARPP 32磷酸化水平和蛋白含量的变化。结果表明 ,短暂性缺血纹状体DARPP 32的免疫学活性和蛋白含量无明显改变。在缺血 10min内 ,随缺血时间的延长 ,体外DARPP 32的 [32 P]的掺入量在缺血 5min时升高 ,在缺血 2、7、10min时均降低 ,而反向磷酸化的测定结果表明体内DARPP 32磷酸化水平增高 ,说明缺血可诱导DARPP 32磷酸化水平变化。

DARPP-32、多巴胺系统与神经元信息整合

Dopamine and CAMP-regulated Phosphoprotein(DARPP-32)是脑内新纹状体等重要核团的神经元内存在的一种具有多方面信息调节与整合作用的蛋白质。多巴胺、谷氨酸等神经递质与相应受体结合后,使DARPP-32的34-苏氨酸等的磷酸化状态发生改变,继而影响PP-1、PP2B等重要磷酸酯酶的活性,使神经元内从各种途径获取的信息得以整合,神经元的生理功能及其控制的行为发生改变。DARPP-32的功能与多种神经递质及其受体密切相关,其功能可用基因敲除技术进行探究。

止颤汤对帕金森病异动症大鼠DARPP-32磷酸化表达的影响

目的观察止颤汤对帕金森病异动症(LID)大鼠行为学和纹状体DARPP-32(Thr-34)磷酸化表达的影响。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射于大鼠脑部黑质造成帕金森病模型,进一步予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射制作异动症(LID)模型。实验设立正常组、模型组、西药组及中药小、中、大剂量组,并采用异常不自主运动(AIM)评分及Western Blotting法观察各组大鼠的行为学及DARPP-32(Thr-34)磷酸化的表达情况。结果 AIM评分显示,止颤汤可以缓解LID大鼠的不自主运动行为,长期用药后,中药中剂量组评分明显下降,但与大剂量组相比差异无统计学意义。Western blotting结果显示:模型组大鼠磷酸化DARPP-32(THr34)的灰度值较正常组增高(P<0.01);西药组磷酸化DARPP-32(THr34)灰度值与模型组比较,差异无统计学意义。中药大、中、小剂量组大鼠纹状体磷酸化DARPP-32(THr34)灰度值与西药组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。中药中剂量、大剂量组磷酸化DARPP-32(THr34)的灰度值较中药小剂量组降低(P<0.05),而中药中剂量组与中药大剂量组比较差异无统计学意义。结论止颤汤可以有效缓解异动症的症状,降低纹状体DARPP-32(Thr-34)磷酸化的表达,可能是止颤汤治疗异动症的作用机制。

DARPP-32磷酸化参与天芪平颤颗粒缓解帕金森病运动并发症的发生

目的研究天芪平颤颗粒对帕金森病(PD)运动并发症大鼠异常不自主行为学及纹状体DARPP-32(Thr75)磷酸化表达的影响,探讨长期左旋多巴使用后天芪平颤颗粒对异动症(LID)的作用机制。方法 6-羟基多巴胺(6-OHDA)制备PD大鼠模型并给予左旋多巴治疗4周,制备LID大鼠模型,将LID大鼠随机分为5组,分别给予大鼠生理盐水(LID模型组)、左旋多巴(西药组)以及小、中、大剂量天芪平颤颗粒组,另设假手术组(n=5)为对照组,并用免疫组化和Western blotting法观察各组大鼠纹状体内磷酸化DARPP-32(Thr75)的表达情况。结果长期使用左旋多巴后,PD大鼠出现刻板运动和进行性增加的对侧旋转等行为学改变。天芪平颤颗粒可明显缓解LID大鼠的不自主运动行为。免疫组化结果显示,西药组磷酸化DARPP-32(THr75)表达较LID模型组降低〔(3.53±0.20)×104 vs.(3.85±0.30)×104,P<0.05〕,大、中、小剂量中药组磷酸化DARPP-32(THr75)表达量分别为(8.54±0.17)×104、(8.10±0.31)×104、(7.06±0.69)×104,较西药组升高(P<0.05)。Western blotting结果与免疫组化基本一致,西药组磷酸化DARPP-32(THr75)灰度值与LID模型组比较无统计学差异〔(0.97±0.24)×106 vs.(1.08±0.12)×106,P>0.05〕,大、中、小剂量中药组大鼠纹状体磷酸化DARPP-32(THr75)灰度值分别为(2.40±0.09)×106、(2.37±0.16)×106、(1.44±0.14)×106,较西药组升高(P<0.05)。结论天芪平颤颗粒可降低LID大鼠的异常不自主运动评分,其机制可能是通过逆转磷酸化DARPP-32(THr75)表达的进一步下降,从而抑制了PKA通路的过度活化;DARPP-32磷酸化参与了治疗PD运动并发症的机制。

DARPP-32磷酸化状态与左旋多巴诱发异动症形成间关系的研究

目的:研究纹状体区DARPP-32磷酸化水平变化和直接通路活动的改变在左旋多巴诱发的异动症(LID)形成中所起的作用。方法:以SCH23390(D1受体拮抗剂)治疗LID大鼠,观察LID大鼠的行为学改变,并用逆转录聚合酶链反应技术检测LID大鼠纹状体区前强啡肽原(PDyn)基因mRNA的表达情况,免疫印迹技术检测纹状体内DARPP-32蛋白Thr-34位点和Thr-75位点磷酸化修饰水平的变化。结果:LID大鼠纹状体区PDyn mRNA基因表达和磷酸化的Thr-34位点DARPP-32水平较对照组均明显增高,Thr-75位点磷酸化无显著改变。经SCH23390治疗后,LID大鼠异常不自主运动明显减少,PDyn基因表达和Thr-34位点磷酸化水平降低,Thr-75位点磷酸化水平升高。结论:大鼠纹状体区PDyn基因表达和Thr-34位点磷酸化水平的升高与LID的形成有关,提示直接通路活动异常及基底节环路功能异常参与了LID的发生。

精神分裂症患者伏隔核的DARPP-32及其磷酸化水平

目的探讨DARPP32蛋白及其苏氨酸磷酸化水平和精神分裂症症状的关系。方法取17例精神分裂症患者(I型7例,Ⅱ型10例)和9例对照组的脑组织,蛋白质免疫印迹法测定伏隔核中DARPP32、34PDARPP32和75PDARPP32的水平。结果在脑的伏隔核,对照组、I型组、Ⅱ型组的DARPP32分别为(100.0±7.3)、(70.8±4.7)和(96.2±5.8),(单因素方差分析P<0.05);34PDARPP32分别为(100.0±8.7)、(66.3±7.0)和(102.0±9.2),(单因素方差分析,P<0.05);而75PDARPP32分别为(100.0±19.9)、(79.8±7.0)和(118.1±22.0),(单因素方差分析,P>0.05)。结论DARPP32及其在34苏氨酸磷酸化程度的减少和精神分裂症的阳性症状有关。

DARPP-32在小鼠肾脏中的表达分布

目的研究DARPP-32在小鼠肾脏组织的表达和分布。方法免疫印记和免疫组化方法检测DARPP-32在小鼠肾脏组织的表达和分布。结果在小鼠组织中,抗DARPP-32多克隆抗体可检测到32×103蛋白的表达;DARPP-32染色阳性细胞位于髓质远曲小管、皮质层近曲小管及髓放射区集合管。结论DARPP-32很可能是多巴胺调节肾脏钠离子重吸收的一个重要中间环节。

DARPP-32在大鼠全脑的定位分布

目的探讨DARPP-32在大鼠全脑的表达分布特点。方法应用免疫组织化学染色技术对大鼠脑内DARPP-32的表达分布进行观察。结果免疫组织化学染色结果显示,强阳性的DARPP-32染色大部分分布于基底节区和前嗅皮质区,主要分布在伏隔核、尾壳核及杏仁核复合体的神经元胞体内,以及苍白球、腹侧苍白球、脚间核及黑质网状部的神经纤维中;中～弱阳性DARPP-32免疫染色见于中脑红核、隔伞核、小脑的普肯耶神经元、内侧缰核、皮层及海马等区域;阳性DARPP-32主要定位于神经元的胞质、胞核和胞膜上。结论 DARPP-32在大鼠全脑广泛表达,但主要分布于多巴胺能神经元密集投射的脑区,这些区域的神经元富含多巴胺D1受体。DARPP-32可能在多巴胺介导的神经功能中扮演着重要角色。

DARPP-32基因对SH-SY5Y细胞药物敏感性的调节作用

目的:探讨DARPP-32基因对人神经母细胞瘤细胞药物敏感性的调节作用。方法:构建DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体,并将它们转导入人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后药物敏感性的变化;流式细胞仪检测细胞转染前后对阿霉素的蓄积浓度的变化;RT-PCR和Western blotting检测细胞转染前后耐药相关蛋白P-gp、MRP和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达变化。结果:成功构建了DARPP-32基因的真核表达载体和小干扰RNA载体;筛选到稳定的DARPP-32高/低表达的神经母细胞瘤细胞模型;MTT试验和流式细胞仪检测结果显示,上调DARPP-32的表达能够显著增强神经母细胞瘤细胞对长春新碱、阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂的敏感性,提高细胞内阿霉素的蓄积(P<0.05),转染DARPP-32小干扰RNA后的细胞对化疗药物的敏感性降低,细胞内的阿霉素蓄积量显著减少(P<0.05);RT-PCR和Westernblotting结果显示,DARPP-32能够下调P-gp和Bcl-2的表达。结论:DARPP-32基因能够调节神经母细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性,具有较好的临床应用前景。

DARPP-32与脑功能障碍

多巴胺和环磷酸腺苷调节的磷蛋白(DARPP-32)是在多巴胺信息传递及整合过程中的一个关键分子,其通过自身不同位点的磷酸化对蛋白质磷酸化和去磷酸化过程发挥着双向调控的作用,整合多种胞内信号转导,调节神经元的电学和化学性质以及动物的生理行为反应,参与多种生理功能和病理过程。本文就DARPP-32的结构、功能和其调节作用及其在脑功能障碍相关疾病研究中的应用予以综述。

DARPP-32磷酸化异常与LID形成机制研究进展

随着人口老龄化的日趋明显，帕金森病（Parkin-son’sdisease，PD）发病率日渐攀升。迄今为止，左旋多巴（L-dopa，LD）凭借其起效快、减轻症状明显等优点，仍然是治疗PD的“金标准”药物，是其他治疗方法和药物所不能替代和比拟的嵋。

电针“曲池”“足三里”穴对缺血再灌注损伤大鼠纹状体DARPP-32磷酸化的影响

目的观察电针"曲池""足三里"穴对脑缺血再灌注损伤局灶性大脑中动脉闭塞模型(MCAO)大鼠神经行为学的变化及多巴胺和环磷酸腺苷调节的蛋白(DARPP-32)磷酸化的影响。方法将25只雄性SD大鼠随机分为假手术组(6只)、手术组(19只)。手术组采用Longa线拴法制备左侧左侧大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠模型,将造模后符合纳入标准的12只大鼠随机分为模型组、电针组,各6只。电针组取"曲池"和"足三里"穴,电针干预14 d,假手术组和模型组在同等条件下抓取及固定,不予任何干预。通过神经功能评分判断大鼠的神经功能缺损情况;小动物磁共振仪(MRI)扫描观察脑梗死体积,Western blot检测纹状体DARPP-32、p-Thr75-DARPP-32的表达情况。结果与模型组相比,电针组大鼠神经功能评分降低(P<0.05),脑梗死体积减少(P<0.05),纹状体p-DARPP-32-Thr75/DARPP-32比值增高(P<0.05)。结论电针"曲池"和"足三里"穴可改善MCAO大鼠神经功能缺损症状,其机制可能与促进缺血纹状体的DARPP-32在Thr75位点的磷酸化有关。

健脾柔肝息风汤对抽动障碍模型大鼠脑组织神经元中DARPP-32、TH含量的干预作用

目的研究健脾柔肝息风汤对抽动障碍(TD)模型大鼠皮质-纹状体-丘脑-皮质回路中多巴胺和环磷酸腺苷调节的磷蛋白(DARPP-32)、酪氨酸羟化酶(TH)含量的影响及其作用机制。方法将40只SD大鼠随机分为空白组(10只),造模组(30只),造模成功后,将造模组随机分为模型组、氟哌啶醇组和健脾柔肝息风汤组,每组10只,腹腔注射给药7 d,采用HE染色观察大鼠大脑皮层各区形态结构和神经元细胞形态变化,采用免疫组织化学染色检测DARPP-32及TH的表达。结果与空白组比较,模型组运动行为评分、刻板行为评分均上升,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,健脾柔肝息风汤组、氟哌啶醇组运动行为评分、刻板行为评分均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组大鼠比较,模型组、氟哌啶醇组及健脾柔肝息风汤组大鼠的DARPP-32、TH水平降低(P<0.05);与模型组比较,氟哌啶醇组及健脾柔肝息风汤组DARPP-32、TH水平升高,其平均光密度差异有统计学意义(P<0.05);氟哌啶醇组与健脾柔肝息风汤组DARPP-32、TH平均光密度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论健脾柔肝息风汤可升高TD模型大鼠脑组织中DARPP-32、TH的含量,从而调节多巴胺能神经系统功能平衡,减少大鼠抽动症状的产生。

CREB和DARPP-32的磷酸化对海马前额叶皮层LTP的影响

动物实验中，海马腹侧的一定刺激形式可在前额叶皮层产生突触后电位长时程增强（LTP）。产生于海马到前额叶皮层神经元的L1P有赖于N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体的可塑性并依赖cAMP激酶（PKA）的活性。海马的LTP分为两期，即早期LTP和晚期LTP。早期LTP的特征是蛋白激酶活化，晚期LTP的特征是基因表达的变化和新蛋白合成。目前对于此LTP的表达形式了解不多，

DARPP—32的结构、功能及其调节机制

DARPP-32是一种多巴胺（DA）和cAMP调节的磷蛋白，存在于所有接受DA能投射的神经元中，在中枢神经系统的分布与DAD1受体的分布非常一致。DA通过D1受体使DARPP-32第34位苏氨酸磷酸化，磷酸化DARPP-32成为蛋白磷酸酶1（PP-1）的强效抑制剂，在两个不同位点与PP-1相互作用，从而抑制PP-1活性。DARPP-32／PP-1级联反应在调节，如钙通道、电压依赖性钠通道、Na＋,K＋-ATPase和NMDANR1受体的功能等神经元兴奋性过程中起重要作用。DA对DARPP—32的磷酸化状态有双向调节作用，其他许多神经递质亦可调节其磷酸化状态。

左旋千金藤啶碱D1激动作用增加6—OHDA损毁大鼠的DARPP—32磷酸化效应

为了进一步阐明ＳＰＤ对大鼠纹状体突触后Ｄ１受体的激动作用特性，本文应用反磷酸化在体内测定及放射配体结合方法，分别观察ＳＰＤ对６ＯＨＤＡ损毁大鼠纹状体ＤＡＲＰＰ３２体内磷酸化作用及突触后Ｄ１受体密度的影响。结果表明：皮下给予ＳＰＤ（２０，４０ｍｇ／ｋｇ，２１ｄ），损毁侧纹状体ＤＡＲＰＰ３２体外［３２Ｐ］的掺入量较健侧下降５０％（Ｐ＜００１）。换言之，损毁侧纹状体内ＤＡＲＰＰ３２的磷酸化程度增加了。然而，ＳＰＤ使损毁导致Ｄ１受体上调的作用减弱（Ｂｍａｘ从３８５０±２６１ｆｍｏｌ／ｍｇ降至３１９７±２０１ｆｍｏｌ／ｍｇ水平）。因此，ＳＰＤ激动Ｄ１受体，使６ＯＨＤＡ损毁大鼠纹状体内ＤＡＲＰＰ３２磷酸化作用加强，而受体密度减少。这是ＳＰＤ调节脑内Ｄ１受体信号转导功能的重要机制。